液相色譜-大氣壓化學電離串聯質譜法測定蔬菜中百菌清殘留

李凌云 許曉敏 林 桓 劉廣洋 黃曉冬 高 慧 徐東輝 裴志國

（1.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業農村部蔬菜質量安全控制重點實驗室，農業農村部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京100081； 2.島津企業管理 （中國）有限公司，北京 100020； 3.中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京100085）

百菌清（chlorothalonil，CTN）是一種高效、廣譜的有機氯殺菌劑，對多種作物的真菌病害有良好的防治效果，因此在我國的蔬菜、水果、水稻等作物生產中應用非常廣泛[1]。由于百菌清在植物上的黏著性較強，不易被雨水沖刷，難以降解且藥效期較長等特點[2]，極易在蔬菜和水果中殘留，從而對農產品的質量安全造成影響。大量的研究表明，百菌清對魚類和水生無脊椎動物具有明顯的毒性，其中許多魚類的 96 h 半致死量 （LC50）為 10～195 μg/L[3]。除此之外，人們還發現長期低劑量的百菌清暴露甚至可以抑制青春期小鼠卵巢的發育[4]。因此對蔬菜和水果中殘留的百菌清進行快速準確的測定，對于保障人們的餐桌安全至關重要。目前報道的檢測百菌清的方法主要有液相色譜法[5～6]，氣相色譜法[7～9]，氣相色譜-質譜聯用法[10～11]。但這些檢測方法的樣品前處理過程繁瑣，不但需要SPE柱凈化，且耗時較長。而液相色譜-串聯質譜技術因具有抗干擾能力強、選擇性好、靈敏度高等優點，已成為農藥殘留檢測的首選方法[12～15]。但百菌清的分子結構（見圖1）中包含一個苯環和與苯環連接的4 個氯原子和2 個氰基，這樣的結構特點決定了它在常見的電噴霧離子源 （ESI）中很難電離，因此，目前液相色譜-串聯質譜檢測百菌清的研究在國內還未見報道。本研究采用APCI 對百菌清進行分析，建立了負離子MRM 模式的檢測方法，并將該方法應用于蔬菜中百菌清殘留的測定。

一、實驗部分

（一）儀器、試劑與材料LC-30A 超高效液相色譜儀和LC-MS/MS-8050 三重四極桿質譜儀均購自日本Shimadzu 公司。

乙腈、甲醇 （HPLC 級，美國 JT Baker 公司）；乙酸銨 （HPLC 級，美國 Fluka 公司）； 水 （超純水，Milli-Q 超純水儀制備）； 百菌清 1 000 mg/L標準溶液購自農業農村部環境保護科研監測所； 其他試劑均為分析純，購自北京化學試劑公司。

番茄、西葫蘆、芹菜、大白菜、花椰菜、結球甘藍分別代表茄果類、瓜類、葉菜類、白菜類和甘藍類等不同類型蔬菜。

（二）樣品處理稱取10.0 g 均質后蔬菜試樣于 50.0 mL 離心管中，加入 20.0 mL 乙腈，振蕩提取 30 min 后 （300 r/min），加入 5.0 g 氯化鈉，手動劇烈振搖 1 min，以 5 000 r/min 離心 3 min 后，取上層乙腈相，過 0.22 μm 濾膜，濾液供分析。

（三）儀器條件色譜柱： Phenomenex Kinetex C18 （50 mm ×3 mm，2.6 μm）； 流動相： A 相為甲醇； B 相為乙酸銨（1.0 mmol/L）水溶液； 梯度洗脫條件： 0min，20%A； 0 ～5 min，20%～95%A；5 ～7 min，95%A； 7 ～7.1 min，95% ～20%A；7.1～12 min，20%A； 流速為 0.3 mL/min； 柱溫為40℃； 進樣量為 1 μL。

APCI 離子源； 負離子掃描； MRM 監測模式；電暈針電壓3 500 V； 霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量5 L/min，以上2 種氣體均為氮氣； 接口溫度350℃； 脫溶劑管溫度 200℃； 加熱模塊溫度200℃； 碰撞氣壓力 2.7×105Pa，該氣體為氬氣。

二、結果與討論

（一）質譜條件的優化在APCI 源負離子模式下，對百菌清的一級質譜進行掃描 （見圖2），結果只檢測到一個離子m/z245。根據同位素比例3∶3∶1，推測該離子m/z245 為 4-羥基百菌清[C8N2OCl3]-。它可能是百菌清在離子源中發生水解反應，4 號位的氯原子被羥基取代所致 （見圖1）。為了驗證該結論的正確性，實驗比較了該離子m/z245 與4-羥基百菌清母離子[M-H]-的二級譜圖（見圖3），結果表明，在相同的碰撞能量下，兩者均得到 4 個碎片離子峰m/z147、175、182 和 210，且碎片離子峰的豐度比基本一致。因此百菌清一級譜中的離子峰m/z245 即是4-羥基百菌清的質譜峰。本實驗以m/z245 作為百菌清的母離子，對其二級質譜進行分析，并選取豐度較高，干擾較小的兩對子離子m/z175、182 為定性離子，對四極桿預桿偏置電壓 （Q1 Pre Bias 和 Q3 Pre Bias）、碰撞能量（CE）等進行優化，優化的質譜參數見表1。百菌清的質譜參數同樣也可以檢測4-羥基百菌清，但兩個化合物的保留時間是不同的 （見圖4）。

圖1 百菌清及其母離子的分子結構式

圖2 百菌清的一級全掃描質譜圖

圖 3 百菌清 （A）和 4-羥基百菌清 （B）的二級譜圖

表1 百菌清的監測離子對及質譜參數

（二）流動相的優化考察了甲醇/ 水、乙腈/水、甲醇/ 乙酸銨溶液為流動相時對百菌清色譜行為的影響。結果顯示，利用甲醇/ 水做流動相時，百菌清的響應值好于乙腈/ 水做流動相，因此本實驗選擇甲醇做有機相。另外，當在甲醇/ 水溶液中加入1.0 mmol/L 濃度的乙酸銨時，百菌清的響應有所提高，進一步增加乙酸銨的濃度（2.5、5.0、10.0 mmol/L）對百菌清的響應影響不大。綜合考慮，本實驗選取甲醇/1.0 mmol/L 乙酸銨溶液做為最終的流動相。優化條件下百菌清的色譜圖見圖4。

圖 4 4-羥基百菌清（1）和百菌清（2）標準溶液（0.1 mg/L）的MRM 色譜圖

（三）基質效應考察在質譜分析中，基質中共提取的干擾物質會影響目標化合物的離子化，從而增強或抑制化合物在儀器上的響應，這些影響和干擾被稱為基質效應。由于基質效應會影響分析方法的準確度，因此必須對基質效應進行考察。本文采用標準曲線法評價基質效應。分別用溶劑和空白基質溶液配制系列標準溶液，繪制標準曲線。

公式 （1）[17]中，k1為溶劑標準曲線的斜率，k2為基質匹配標準曲線的斜率。ME為正數表示基質增強效應，為負數表示基質抑制效應。|ME| 在0～20%時，為弱基質效應，在20%～50%時為中等基質效應，＞50%時為強基質效應。結果如圖5所示，百菌清在各蔬菜中均表現為基質增強效應，即基質的存在，有助于百菌清在離子源發生脫氯水解反應，從而使百菌清的信號增強。在5 種蔬菜中，番茄的基質效應（22.1%）最小，屬于中等基質效應。大白菜和西葫蘆中百菌清雖也表現為中等基質效應，但它們的基質效應較番茄高很多，分別為49.2%和47.4%。在芹菜和花椰菜中百菌清表現為強基質效應，分別為59.4%和59.5%。由于百菌清在各種蔬菜中的基質增強效應明顯，為了更好地消除基質效應的影響，本實驗采用空白基質配制標準溶液對百菌清進行定量，以確保檢測結果的準確可靠。

圖5 百菌清在5 種蔬菜中的基質效應

（四）線性范圍、線性關系和定量限用番茄、芹菜、花椰菜、西葫蘆和大白菜的空白基質溶液，分別配制質量濃度為 0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25 和 0.5 mg/L 的百菌清標準溶液，按上文檢測方法進行分析，以色譜峰面積 （y）對其質量濃度 （x，mg/L）繪制標準工作曲線 （見表 2）。結果顯示，在 1～500 μg/L 范圍內，百菌清線性關系良好，相關系數 （r）為 0.998 7～0.999 8。

表2 百菌清在不同基質中的線性范圍、線性方程和相關系數

方法定量限 （LOQ）通過加標回收進行確定。符合一定正確度和精密度要求的最低加標濃度為定量限。百菌清在番茄、芹菜、大白菜和西葫蘆4 種蔬菜中的定量限均為0.01 mg/kg。在該濃度水平下，百菌清的平均回收率為67.0%～92.6%，RSD為4.6%～13.4%，回收率和精密度數據同時滿足農業部2386 號公告 《農藥殘留檢測方法國家標準編制指南》 的要求。

（五）回收率與精密度在空白番茄、芹菜、花椰菜、西葫蘆、大白菜和結球甘藍樣品中，分別添加0.01、0.1 和0.5 mg/kg 3 個濃度水平的百菌清進行添加回收試驗，每個濃度水平平行測試6 次。百菌清在5 種蔬菜基質中的平均加標回收率和精密度結果見表3，可以看出，蔬菜基質種類明顯影響百菌清的回收率。在番茄、芹菜、西葫蘆和大白菜4 種蔬菜基質中，百菌清的平均回收率為67.0%～104%，RSD 為1.4%～13.4%。方法的正確度和精密度均符合農藥殘留分析的要求。但在甘藍類蔬菜中，百菌清的回收率明顯偏低。如在花椰菜中，3個濃度水平下百菌清的平均回收率分別為40.9%、44.0%和41.4%，而在結球甘藍中百菌清的回收率則為0。因此本研究推測可能是甘藍類蔬菜中的某些物質與百菌清發生了降解反應，從而導致百菌清的回收率偏低。在近來的研究中，王禹等[18]發現甘藍葉片水提取液可以明顯加快百菌清的光降解速率，他們推測可能是水提液中酚類和黃酮類物質的存在導致了百菌清的降解。而LV 等[19]則發現原花青素可以作為光敏化劑，直接促進水中百菌清的降解。但對于本研究而言，前處理過程是在室內完成，并沒有紫外照射，因此甘藍類蔬菜中具體什么物質導致了百菌清降解，還有待進一步研究。

表3 百菌清在5 種蔬菜基質中的平均加標回收率和精密度（RSDs）（n=6）

（六）實際樣品的檢測應用本文所建立的方法對例行監測抽檢的40 份蔬菜樣品中的百菌清進行了檢測，結果顯示，40 份樣品均未檢出百菌清。

三、結論

本研究建立了液相色譜-大氣壓化學電離串聯質譜測定蔬菜中百菌清殘留的快速檢測方法。樣品經乙腈提取，過濾后直接進行儀器檢測，省略了繁瑣的凈化步驟。該方法簡便、快速、可用于番茄、西葫蘆、芹菜和大白菜等蔬菜中百菌清的快速篩查與檢測，但不適用于花椰菜和結球甘藍等蔬菜。