蜂蜜中26 種磺胺及其增效劑類藥物殘留檢測方法研究

宋梓豪 石會娟 王 鵬 趙 文 張金振 黃京平 金 玥

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

磺胺類藥物是一類具有對氨基苯磺酰結構的廣譜抗菌類藥物，目前約有150 種[1]。由于其價格低廉、穩定、高效等特點，在畜牧業和獸醫臨床中已廣泛用于預防和治療細菌感染[2～4]。在養蜂業中，磺胺及其增效劑可用于防治蜂群高發病美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病等細菌性幼蟲病，有利于降低蜜蜂死亡率[5～6]。但是由于磺胺類藥物在動物體內代謝、降解緩慢，大量違規用藥，會造成磺胺類藥物在蜜蜂體內殘留，并遷移至蜂產品中[3，7～10]。長期食用此類蜂產品，會引發過敏、抗藥性，甚至導致造血紊亂等問題，直接危害人體健康。同時磺胺增效劑三甲氧芐氨嘧啶在人體內蓄積會引起骨髓微核抑制，偶發有白細胞、血小板的減少等癥狀；磺胺增效劑二甲氧芐氨嘧啶現已確定具有遺傳毒性[11]。目前，大多數國家都禁止在蜜蜂飼養過程中使用磺胺類藥物。

我國已建立多個檢測標準用于蜂產品中磺胺類藥物的殘留檢測，主要包括GB/T 18932.17-2003

《蜂蜜中16 種磺胺殘留量的測定方法 液相色譜-串聯質譜法》 和GB/T 22943-2008 《蜂蜜中三甲氧芐氨嘧啶殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》。這兩個標準前處理方法均采用固相萃取法，其中GB/T 18932.17-2003 需采用陽離子交換柱、親水親脂平衡（HLB）固相萃取柱，兩步固相萃取方法對蜂蜜樣品進行凈化，前處理過程較為復雜。目前，已用于食品中磺胺類藥物檢測的前處理方法主要有液液萃取[7，12]、固相萃取[13～14]和固相微萃取方法[15～16]。基于固相微萃取的 QuEChERS 方法由于其簡便、快速、高效等特點，目前被廣泛用于食品中農藥和獸藥的檢測[17～21]。本文采用QuEChERS前處理方法和超高效液相色譜-串聯質譜（UHPLC-MS/MS）檢測技術，研究建立蜂蜜中23 種磺胺和3 種磺胺增效劑類藥物的快速、高效、高通量檢測方法，并與混合型強陽離子交換（MCX）和非極性/ 陽離子交換（PCX）固相萃取前處理方法進行比較。

一、材料與方法

（一）材料與儀器

1.測試樣品。本試驗測試所用蜂蜜樣品購買于超市。

2.材料與試劑。23 種磺胺類藥物： 磺胺醋酰（ sulfacetamide，CAS： 144 -80 -9），磺 胺 脒（sulfaguanidine，CAS： 57-67-0）、磺 胺 吡 啶（sulfapyridine，CAS： 144 -83 -2）、磺 胺 嘧 啶（sulfadiazine，CAS： 68-35-9）、磺胺甲基異噁唑（sulfamethoxazole，CAS： 723-46-6）、磺胺噻唑（sulfathiazole，CAS： 72-14-0）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，CAS： 127-79-7）、磺胺二甲異噁唑（sulfisoxazole，CAS： 127 -69 -5）、磺 胺 惡 唑（sulfamoxole，CAS： 729-99-7）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，CAS： 144-82-1）、磺 胺 苯 酰（sulfabenzamide，CAS： 127-71-9）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，CAS： 57-68-1）、磺胺二甲異嘧啶（sulfisomidine，CAS： 515-64-0）、磺胺間甲氧嘧啶 （sulfamonomethoxine，CAS： 1220-83-3）、磺胺對甲氧嘧啶 （sulfameter，CAS： 651-06-9）、磺 胺 甲 氧 噠 嗪 （sulfamethoxypyridazine，CAS：80-35-3）、磺 胺 氯 吡 嗪 （sulfachloropyrazine，CAS： 102-65-8）、磺胺氯噠嗪 （sulfachloropyrid azine，CAS： 80-32-0）、磺胺喹噁啉 （sulfaquinoxaline，CAS： 59-40-5）、磺胺鄰二甲氧嘧啶 （sulfadoxin，CAS： 2447-57-6）、磺胺間二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，CAS： 122-11-2）、磺胺苯吡唑 （sulfaphenazole，CAS： 526-08-9）、磺胺硝苯（sulfanitran、CAS： 122-16-7），3 種磺胺增效劑：二甲氧芐氨嘧啶 （diaveridine，CAS： 5355-16-8）、二甲氧甲基苯氨嘧啶 （ormetoprim，CAS： 6981-18-6）、三甲氧芐氨嘧啶 （trimethoprim，CAS：738-70-5），所有標準品純度均≥98%，均購于阿爾塔科技有限公司 （First Standard）； 乙腈、甲酸，色譜純，購于美國 Fisher Scientific； 氯化鈉 （分析純）、無水硫酸鈉 （分析純）、乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA，40～60 μm）吸附劑、十八烷基硅烷鍵合硅膠 （C18，40～60 μm）吸附劑、PCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL）均購于美國安捷倫公司； MCX 固相萃取柱 （60 mg，3 mL），購于美國沃特世公司； 試驗用水均為超純水。

3.儀器與設備。UHPLC-MS/MS，電噴霧電離源 （ESI）（6495，安捷倫，美國）； 分析天平 （萬分之一天平，梅特勒-托利多，上海）； 高速離心機（CR22GⅡ，日立，日本）； 超純水儀（Integral5，Milli-Q，美國）。

4.標準溶液配制。（1）26 種磺胺類藥物標準儲備液 （0.1 mg/mL）的配制： 準確稱取適量的每種磺胺標準物質，用甲醇配成0.1 mg/mL 的標準儲備溶液，該溶液在-20℃保存，可使用 6 個月。（2）基質匹配混合標準工作溶液： 用空白樣品提取液稀釋標準儲備液，配成不同濃度的基質匹配混合標準工作溶液，在4℃保存，當天配制。

（二）實驗方法

1.色譜條件。色譜柱為安捷倫 Poroshell 120EC-C18 色譜柱 （2.1×100 mm，2.7 μm）； 流動相： A 相為 0.1%甲酸溶液，B 相為乙腈； 柱溫為35℃； 流速為 0.3 mL/min； 進樣量為 5 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.質譜條件。離子源為電噴霧離子源，正離子模式； 掃描方式為多反應監測 （MRM）； 干燥氣溫度為350℃； 干燥氣流速為7 L/min； 霧化器壓力為 40 psi； 鞘氣溫度為350℃； 鞘氣流速為 12 L/min； 毛細管電壓為 3 500 V； 噴嘴電壓為 0 V；選擇離子參數設定見表2。

3.樣品前處理方法。（1）QuEChERS： 稱取蜂蜜樣品 5.0 g （精確至±0.05 g）于 50 mL 塑料離心管中，加入 5 mL 水渦旋混勻。加入 10 mL 乙腈渦旋振蕩 5 min，加入 4 g Na2SO4和 1 g NaCl 渦旋振蕩 1 min，于 4℃下 8 000 r/min 離心 5 min。吸取 6 mL 上清液加入含有 50.0 mg PSA、150.0 mg C18和900.0 mg Na2SO4的15 mL 離心管中，渦旋混勻1 min。于 4℃下 8 000 r/min 離心 5 min，準確吸取2 mL 上清液于10 mL 離心管中，40℃水浴中氮吹至近干。加入 1 mL 乙腈-水溶液復溶 （1∶9，v/v），經 0.22 μm PES 濾膜過濾后待測。（2）固相萃取： 主要參考國家標準 GB/T 22947-2008 和GB/T 18932.17-2003 的前處理方法并進行了優化。稱取蜂蜜樣品5.0 g 于50 mL 具塞的聚丙烯試管中，加入20 mL 水，加入0.5 mL 50%三氯乙酸溶液，快速振搖 1 min，以 8 000 r/min 離心 5 min，移取上清液至三角瓶中，再向殘渣中加入15 mL三氯乙酸溶液（1%），重復提取1 次，合并上清液，待凈化。取PCX 固相萃取柱 （或MCX 固相萃取柱），依次用 5 mL 甲醇、5 mL 水活化固相萃取柱，將上述待凈化樣品以＜3 mL/min 流速通過小柱，待樣液完全流出后，依次用 5 mL （0.1 mol/L）鹽酸溶液和5 mL 純甲醇洗柱，棄去全部流出液。用6 mL 氨水-甲醇 （1∶19）溶液洗脫，收集洗脫液于10 mL 濃縮管中，40℃下氮吹濃縮至近干，準確加入 1.0 mL 乙腈-水溶液（1∶9，v/v）溶解殘渣，樣液過 0.2 μm 濾膜后，供 UHPLC-MS/MS 測定。

表2 MRM 監測模式下26 種磺胺及磺胺增效劑的質譜采集參數

二、結果與分析

（一）QuEChERS 前處理條件的優化QuECh-ERS 包含液液萃取和固相微萃取凈化兩步。提取溶劑和吸附劑的選擇是決定QuEChERS 前處理方法提取效率和凈化效率的關鍵參數。目前常用于蜂蜜中獸藥殘留提取的溶劑有乙腈、甲醇和乙酸乙酯。已有研究表明，乙腈可有效提取蜂蜜[5，16]、蛋及蛋制品[21]等樣品中的磺胺類藥物。因此，本文選用乙腈作為提取溶劑。

QuEChERS 常用的吸附劑主要是C18、PSA。C18 具有去除脂肪的功能，而PSA 主要可以去除脂肪酸、糖、有機酸、酯類以及少量色素[19]。C18和PSA 聯合使用已廣泛用于食品中多種獸藥、農藥的凈化提取。由于蜂蜜中主要含有糖 （80%，果糖+ 葡萄糖）以及少量的氨基酸、蛋白質和脂肪，因此選用C18+PSA 吸附劑組合對樣品基質進行凈化，更有利于減少基質干擾。為優化吸附劑的使用劑量，本研究選取兩組不同劑量的吸附劑：（1）50 mg 的 C18 和 150 mg 的 PSA；（2）400 mg 的 C18和400 mg 的PSA。兩組不同劑量組合的吸附劑處理下，添加樣品 （5.0 μg/kg）中 26 種化合物的回收率分布情況如圖1 所示，可以看出，增加吸附劑的使用劑量并未能提高待測組分的回收率，反而會引起過量吸附劑吸附樣品中的待測組分，從而導致回收率偏低。因此，本文選用 50 mg C18、150 mg PSA 作為吸附劑的最優化劑量。

容裕棠等[16]利用胺丙基鍵合硅膠 （NH2），建立了蜂蜜中21 種磺胺的QuEChERS 前處理方法。與該方法相比，本研究利用PSA 和C18 作為吸附劑建立的QuEChERS 方法進一步拓展了磺胺類藥物的檢測范圍，不僅增加了二甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶兩種常見的磺胺增效劑，同時該方法還能夠有效提取磺胺脒和磺胺醋酰這類極性較強的磺胺類藥物。并且由于PSA 和C18 凈化范圍廣、適用性強，采用其作為吸附將有利于此方法推廣至其他蜂產品和畜產品檢測中。

（二）QuEChERS 方法與固相萃取法相比較目前國家標準方法對動物源性食品 （蜂蜜、蜂王漿、牛奶、肉等）中磺胺類藥物以及磺胺增效劑的前處理方法主要為固相萃取法[22]。梁兆斌等[23]采用MCX 固相萃取柱成功實現蜂蜜中13 種磺胺類藥物的有效提取。本研究將已建立的QuEChERS 方法與固相萃取法進行比較。通過使用PCX、MCX 和QuEChERS 分別處理已知濃度（5 μg/kg）的空白添加樣品，對比其回收率，比較了不同前處理方法的有效性和準確性。從圖1 可以看出，PCX 和MCX固相萃取方法回收率分布相似。然而，極性較強的磺胺脒、磺胺醋酰以及磺胺嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺苯吡唑、磺胺苯酰等藥物的回收率均低于70%。而使用本研究建立的QuEChERS 方法，26 種藥物的回收率均為 80%～120%。由此可見，采用QuEChERS 方法，上述極性較強的藥物均獲得了較好的回收率，可以更有效地同時提取蜂蜜中26種磺胺及其增效劑類藥物。

（三）方法學評價

圖1 不同前處理方法26 種化合物的回收率分布情況

1.基質效應。基質效應 （ME）是通過比較基質匹配標準溶液得到的標準曲線斜率和純試劑配制的標準溶液獲得的標準曲線斜率來評估基質干擾情況，一般以兩者比值進行評估； 得到的ME＞120%為基質增強，ME＜80%為基質抑制[24]。從表 3 中結果可以看出，4 種磺胺藥物存在基質抑制 （磺胺脒、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺硝苯），1 種藥物 （磺胺間二甲氧嘧啶）表現為基質增強，為了消除基質帶來的影響，本研究采用基質匹配標準溶液對樣品組分進行定量測定。

2.線性。空白樣品經前處理，得到空白基質溶液，并用空白基質溶液配制一系列基質匹配標準溶液（0.5、1.0、5.0、10、50 和 100 μg/L），繪制標準工作曲線。結果顯示，26 個目標化合物在0.5 ～100 μg/L 范圍內呈現良好的線性關系，相關系數（r2）＞0.999。

3.檢出限與定量限。以3 倍信噪比計算，得到該方法檢出限 （LOD）； 以10 倍信噪比計算，得到該方法定量限（LOQ）[25]。26 種磺胺及磺胺增效劑的 LOD 為 0.08～0.57 μg/kg，LOQ 為 0.26 ～1.91 μg/kg。該方法的LOD 均低于現有國家標準（磺胺類為 1～12 μg/kg，三甲氧芐氨嘧啶為 2 μg/kg），具體結果見表3。

4.回收率和精密度。為考察方法的準確度和精密度，進行了添加回收試驗。按照上述處理和測定方法，在空白蜂蜜樣品中添加3 個不同濃度 （1 、5、10 μg/kg），每個水平設 5 個平行，在不同時間重復實驗3 批。26 種藥物的回收率以及批次內、批次間相對標準偏差 （RSD）結果見表4。試驗結果表明，該方法在3 個濃度的添加回收率均為80%～120%，批次內 RSD 為1.45%～8.89%，批次間RSD 為1.73%～10.73%。方法準確度和精密度均可滿足檢測要求。

（四）實際樣品測定利用所建立的方法對市場上購買的50 批次蜂蜜樣品進行測定，未有磺胺類藥物檢出。

表3 26 個化合物的基質效應、回歸系數、定量限與檢出限

表4 蜂蜜中26 種磺胺類藥物添加回收率和相對標準偏差

三、結論

本文利用QuEChERS 前處理技術與UHPLCMS/MS 檢測方法，實現了蜂蜜中26 種磺胺及其增效劑的高效、高通量、高靈敏度檢測。該方法LOD 與LOQ 低于目前現有國家標準方法。與傳統的固相萃取方法相比，不僅簡化了前處理過程，縮短檢測時間，同時拓展了目標化合物的檢測范圍，增加了檢測方法通量，提高了檢測方法效率。