GC法測定4,7-二氯喹啉中的有關物質(zhì)

朱梓良，曾濤，起燕江，3

（1.大理大學藥學與化學學院，云南 大理671003；2.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明650106；3.昆明醫(yī)科大學藥學院，云南昆明650500）

由磷酸萘酚喹和青蒿素組成的復方磷酸萘酚喹片是一種極其有效的抗瘧疾藥物[1-4]。然而，在生產(chǎn)磷酸萘酚喹原料藥的過程中，4,7-二氯喹啉作為該工藝的重要中間體[5-6]，可能含有殘留的乙氧基次甲基丙二酸二乙酯（EMME）以及環(huán)合時生成的副產(chǎn)物4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉[7]，這些雜質(zhì)若被引進磷酸萘酚喹中將直接影響成品的質(zhì)量。

參考過往的研究，雖已有采用填充柱檢測4,7-二氯喹啉中4,5-二氯喹啉含量的GC 方法的文獻報道[8]，但該方法未對4,7-二氯喹啉中可能含有的雜質(zhì)EMME 和4,8-二氯喹啉進行研究。本文建立一種簡便、準確的GC 分析方法，以測定4,7-二氯喹啉中雜質(zhì)EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉的含量，為更準確控制復方磷酸萘酚喹片的產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

XSE205 十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；clarus600 氣相色譜儀（美國PE 公司）；YY-HI-100L超純水儀(成都優(yōu)越科技有限公司）。色譜柱：Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）、Elite-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm，珀金埃爾默儀器有限公司)。

4,7-二 氯 喹 啉(批 號C10142219、C10132378、C10132107，上海麥克林生化科技有限公司）；乙氧基次甲基丙二酸二乙酯(EMME，批號：M180830358，上海麥克林生化科技有限公司）；4,5-二氯喹啉（批號：1916051，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4,8-二氯喹啉（批號：1-NIS-107-1，Toronto Research Chemicals）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，批號：l6C0N30，J&K Scientific Ltd）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）；進樣口溫度：300 ℃；FID檢測器溫度：280 ℃；載氣：N2；流速：2.0 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：10∶1；柱溫：初始180 ℃恒溫4 min，一階速率6.5 ℃/min 升至200 ℃恒溫0 min；二階速率20 ℃/min 升至250 ℃恒溫4 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品儲備液的制備 精密稱取EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉各25 mg，置于50 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解定容，精密量取1 mL 置于10 mL 量瓶，DMF 定容，得質(zhì)量濃度分別為50.0 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密量取1 mL混合對照品儲備液置于10 mL量瓶，DMF定容，得質(zhì)量濃度分別為5.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取4,7-二氯喹啉100 mg 置于20 mL 量瓶，DMF 定容，得質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的供試品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗溶液的制備 精密稱取供試品4,7-二氯喹啉100 mg 置于20 mL 量瓶，加入2 mL的混合對照品儲備液，采用DMF稀釋定容，即得。

2.3 色譜系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項系統(tǒng)適用性試驗溶液，按“2.1”項色譜條件進樣并分析，色譜圖見圖1。可見，各組分的理論塔板數(shù)不低于10 000，且各組分之間的分離度均大于1.5。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗GC色譜圖Figure 1 GC chromatogram of applicability test

2.4 專屬性試驗

分別取“2.2”項混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣分析，色譜圖見圖2。可見，各雜質(zhì)峰與樣品峰均不受溶劑因素干擾且各峰之間完全分離，表明方法專屬性良好。

2.5 定量限和檢測限

精密量取混合對照品儲備液逐級稀釋，按“2.1”項色譜條件進樣檢測，測得EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉的定量限（S/N=10）均為2.5 μg/mL，檢測限（S/N=3）均為0.75 μg/mL。

2.6 標準曲線及線性范圍

分別精密量取混合對照品儲備液3、3、1、2、3、1 mL 置于20、25、10、25、50、20 mL 量瓶中，采用DMF稀釋定容，得6份不同濃度的對照品溶液，分別于“2.1”色譜條件下進樣檢測，記錄色譜圖，以各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標進行線性回歸，結果見表1。

2.7 精密度試驗

2.7.1 儀器精密度 精密量取1 mL混合對照品儲備液置于20 mL 量瓶中，DMF 稀釋定容，按“2.1”項色譜條件重復進樣6 次，記錄EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉3種雜質(zhì)的峰面積，計算其RSD值分別為2.50%、2.45%和2.14%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

圖2 空白溶劑（A）、混合對照品（B）、4,7-二氯喹啉供試品（C）的GC色譜圖Figure 2 GC chromatograms of blank solvent(A),mixed reference substance(B)and sample of 4,7-dichloroquinoline(C)

表1 4,7-二氯喹啉中有關物質(zhì)線性關系考察結果Table 1 Linear relationships of related impurities in 4,7-dichloroquinoline

2.7.2 重復性試驗 精密稱取4,7-二氯喹啉（批號：C10142219）約100 mg置于20 mL量瓶，加入2 mL的混合對照品儲備液，采用DMF 定容，共制備6 份，按“2.1”項色譜條件分別進樣檢測，記錄峰面積。結果顯示雜質(zhì)EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉的峰面積RSD 值分別為2.44%、2.12%、2.76%，均小于3%，表明方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密稱取1 份4,7-二氯喹啉（批號：C10142219）約100 mg 置于20 mL 量瓶，加入2 mL 的混合對照品儲備液，DMF 定容，于室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、12 h 按“2.1”色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。結果測得EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉峰面積RSD 值分別為1.92%、2.14%、2.07%，均小于3%，表明在室溫條件下放置12 h穩(wěn)定性符合要求。

2.9 回收率試驗

精密稱取4,7-二氯喹啉（批號：C10142219）9份，每份約100 mg，分別置于20 mL 量瓶，分為3 組，對應每組分別加入1、2、3 mL 混合對照品儲備液，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件下分別進樣檢測，計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 耐用性試驗

在“2.1”色譜條件基礎上，考察了柱溫和載氣N2流速對雜質(zhì)測定的影響。結果表明，初始溫度波動±10 ℃，最終溫度波動±10 ℃，載氣N2流速波動+0.5 mL/min 范圍內(nèi)，雜質(zhì)的專屬性試驗以及重復性試驗結果均符合要求，顯示方法耐用性良好。

3 樣品的測定

取3 批4,7-二氯喹啉供試品（批號：C10142219、C10132378、C10132107）粉末，按“2.2”項方法制備3批樣品的供試品溶液和混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣分析，以外標法計算已知雜質(zhì)含量，結果顯示：3 批樣品均檢測出了雜質(zhì)4,5-二氯喹啉，質(zhì)量分數(shù)分別為0.07%、0.06%、0.07%；未檢測出雜質(zhì)EMME和4,8-二氯喹啉。

4 討論

4.1 溶劑的選擇

化合物EMME、4,7-二氯喹啉、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉幾乎不溶于水，在甲醇、乙腈和DMF 中可溶。本研究分別比較了采用甲醇、乙腈和DMF 作為溶劑的效果，結果顯示采用DMF作為溶劑時，該4種組分的峰形最好，靈敏度最高。

4.2 色譜柱的考察

考察了Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）和Elite-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm）2 種類型色譜柱，以及3 種不同批號Elite-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm）色譜柱的分離效果，結果顯示均有較好的分離度，且色譜柱Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）的靈敏度更高，因此本研究采用色譜柱Elite-1701（30 m×0.53 mm×0.5 μm）作為固定相并進行分析方法學驗證。

表2 4,7-二氯喹啉有關物質(zhì)加樣回收率試驗結果Table 2 The recoveries of related impurities in 4,7-dichloroquinoline(n=9)

4.3 雜質(zhì)限度的確定

參考ICH Q3a 指導原則，暫定4,7-二氯喹啉中雜質(zhì)EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉的質(zhì)量分數(shù)限度均為0.1%。

本研究建立的GC 檢測方法能簡便、快速、準確地測定出4,7-二氯喹啉中可能含有的相關雜質(zhì)EMME、4,5-二氯喹啉和4,8-二氯喹啉。