奧貝膽酸關鍵雙鍵雜質的合成研究

張尚師，鄭滔，謝曉玲，鄧南翔，舒兵

（廣東藥科大學1.新藥研究中心；2.藥學院，廣東廣州510006）

關鍵字：奧貝膽酸；雜質；合成

奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA，結構式見圖1）通過激動法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，FXR）間接抑制細胞色素7A1（CYP7A1）的基因表達，從而抑制膽酸的合成，用以治療對熊去氧膽酸應答補加或者無法耐受的原發性膽汁性膽管炎，具有較高的安全性[1-4]。但是，在工業化生產奧貝膽酸的過程中，氫化條件較為苛刻，且催化劑隨著反應時間的延長催化性能逐漸下降，導致起始物料中的碳碳雙鍵難以徹底被還原，起始物料中羰基被還原后會引入奧貝膽酸的關鍵雙鍵雜質——（Z）-3α，7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷酸（A-1，結構式見圖1），嚴重影響奧貝膽酸的純度[5-6]。為了建立奧貝膽酸的質量標準，必須對其中的關鍵雜質進行研究，建立該雜質的質量標準。因此，合成該雜質作為對照品，用于后續的分析和研究，顯得很有必要。

圖1 奧貝膽酸（OCA）和奧貝膽酸雙鍵雜質（A-1）的結構Figure 1 The structure of Obeticholic acid(OCA)and double bond impurity(A-1)

本研究以鵝去氧膽酸甲酯為起始原料，通過二異丙基氨基鋰（LDA）拔氫后上TMS 保護劑、三氟化硼（BF3）催化的羥醛縮合反應、對羧酸進行水解和對酮羰基進行還原等步驟得到奧貝膽酸雙鍵雜質A-1，合成路線見圖2。

圖2 奧貝膽酸雙鍵雜質（A-1）的合成路線Figure 2 The synthesis route of Obeticholic acid double bond impurity(A-1)

1 儀器與試劑

1.1 儀器

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義予華有限公司）；ZF-7A 手提式紫外分析儀（杭州齊威儀器有限公司）；N-1300V-W 旋轉蒸發儀（上海艾朗儀器有限公司）；ME104電子天平、SHB-III循環水式多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限公司）；Advance Bruker 400M 超導核磁共振波譜儀（瑞士BRUKER 公司）；Thermo 超高效液相色譜串聯質譜儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試劑

鵝去氧膽酸甲酯（分析純，薩恩化學技術有限公司）；三甲基氯硅烷（分析純，薩恩化學技術有限公司）；乙醛溶液（分析純，上海畢得醫藥有限公司）；三氟化硼乙醚溶液（分析純，上海畢得醫藥有限公司），其余所有溶劑如甲苯、DMF、DCM、EA 等均為化學純。

2 方法與結果

2.1 3α，7-雙[（三甲基硅烷基）氧基]-6-烯-5β-膽烷酸甲酯（2）的合成

稱取鵝去氧膽酸甲酯（1，10.0 g，24.75 mmol）于500 mL 三口瓶中，加入無水四氫呋喃200 mL，換N2保護，換氣5 次，將反應液置于-40 ℃環境中，攪拌20 min 后，滴加27.2 mL 二異丙基氨基鋰（LDA，54.45 mmol，2.0 mol/L in THF），攪拌1 h 后，滴加三甲基氯硅烷（5.92 g，54.45 mmol）。攪拌2 h 后，停止反應，將反應液倒入500 mL 飽和氯化銨溶液中，加入100 mL 乙酸乙酯，攪拌20 min 后分液，水層加50 mL 乙酸乙酯萃取3 次，合并有機層，飽和食鹽水洗3次，無水硫酸鈉干燥，徹底旋干，直接投下一步。

2.2 (Z)-3α-羥基-6-亞乙基-7-氧代-5β-膽烷酸甲酯（3）的合成

將得到的粗品溶于300 mL無水二氯甲烷中，加入5.9 mL 乙醛四氫呋喃溶液（1.2 eq，5.0 mol/L in THF，以原料1 計算），將反應體系降溫至0 ℃，滴加5 mL 三氟化硼乙醚溶液，攪拌3 h 后反應完全，將反應液倒入500 mL 稀鹽酸溶液中，分液，水層加100 mL 二氯甲烷萃取3 次，合并有機層，飽和食鹽水洗3 次，無水硫酸鈉干燥，旋干，硅膠柱層析（PE/EA:64/1-8/1）得到中間體2，6.3 g，兩步反應產率59%。1H NMR(400 MHz,MeOD)δ：6.03(q,J=7.1 Hz,1H),3.64(s,3H),3.62-3.45(m,1H),2.63(dd,J=13.0,4.2 Hz,1H),2.29 (tdd,J=12.3,7.6,2.8 Hz,3H),2.22-2.09 (m, 1H), 2.02 (dd,J=9.6, 3.2 Hz, 1H), 1.98-1.82(m, 3H), 1.81-1.71 (m, 1H), 1.66 (d,J=7.1 Hz, 4H),1.57-1.45 (m, 3H), 1.45-1.35 (m, 2H), 1.33-1.23 (m,3H),1.23-1.04(m,5H),0.99(s,3H),0.92(d,J=6.5 Hz,3H),0.64(s,3H)。ESI-MS(m/z):431.4[M+H]+。

2.3 (Z)-3α-羥基-6-亞乙基-7-氧代-5β-膽烷酸（4）的合成

稱取中間體3（4.0 g，9.3 mmol）于250 mL 反應瓶中，加入50 mL 甲醇，攪拌使之溶解，加入10%NaOH 溶液10.0 mL，50 ℃攪拌1 h。反應結束后，放冷，旋干甲醇，加入20 mL 水，冰浴下攪拌10 min，滴加5%稀鹽酸調pH=4～5，過濾，濾餅用水洗2～3 次，干燥后乙醇重結晶得到中間體4，無需純化，直接投下一步反應。

2.4 (Z)-3α，7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷酸（A-1）的合成

稱取中間體4（2.0 g，4.81 mmol）于250 mL 反應瓶中，加30 mL水攪拌，加入50%NaOH溶液2.0 mL，攪拌使之溶解。滴加由NaBH4（363 mg，9.56 mmol）、1.5 mL 水和0.3 mL 50%NaOH 溶液組成的混合溶液（參照文獻[7-8]方法）。加畢，90 ℃下反應5 h。反應結束后將反應液倒入100 mL 冰飽和NH4Cl 溶液中，攪拌，加飽和檸檬酸溶液調pH=4～5。加30 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，飽和食鹽水洗后無水硫酸鈉干燥，室溫旋干，硅膠柱分離（DCM∶MeOH=120∶1～30∶1，0.5% HAc），得到奧貝膽酸雙鍵雜質A-1，白色固體，1.34 g，產率67%，純度97.2%（示差檢測器），mp 221.3～224.5 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ：5.77-5.54 (m, 1H),4.04-4.01 (m,1H),3.75-3.52(m,1H),2.58-2.36(m,2H),2.34-2.20(m,1H),2.06-1.98(m,1H),1.97-1.78(m,4H),1.76-1.58(m,7H),1.53-1.19 (m,11H),1.18-1.00 (m,2H),0.96 (d,J=6.2 Hz,3H),0.80(s,3H),0.67(s,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ：178.43,140.65,113.55,72.39,70.37,55.19,54.08,44.52,43.77,43.11,39.13,38.69,35.17,34.44,34.36,33.79,30.13,29.94,29.15,27.69,26.21,21.91,20.32,17.51,11.51,11.29。ESI-MS(m/z)：417.1[M-H]+。以上數據與文獻[7-8]報道的一致，詳見圖3。

3 討論

在本合成路線中，使用還原試劑將7-羰基還原為7-α羥基是研究的關鍵。常見的還原劑有氫化鋁鋰、硼氫化鈉、硼氫化鉀、氫氣鈀碳體系等。由于氫化鋁鋰能夠還原羧酸、氫氣鈀碳體系可以還原6-烯基，均不能得到目標雜質A-1。本研究參照奧貝膽酸的合成方法，使用硼氫化鈉進行還原。從立體結構方面來看，7 位的羰基突出于膽烷酸骨架外側，H負離子從位阻較小的環下側進攻羰基，得到動力學穩定的7β-羥基，而在較高溫度下，由于β位空間位阻較大，因此，7β-羥基會轉變為熱力學穩定的7α-羥基。

圖3 奧貝膽酸雙鍵雜質（A-1）的氫譜（A）和碳譜（B）Figure 3 The1H NMR(A)and 13C NMR(B)spectra of Obeticholic acid double bond impurity(A-1)

本研究以鵝去氧膽酸甲酯為起始原料，在LDA作用下，使3α，7 位接上了TMS 保護基，然后在三氟化硼乙醚的催化下，與乙醛發生羥醛縮合反應得到乙烯基鵝去氧膽酸甲酯，最后經堿水解、硼氫化鈉還原羰基后得到奧貝膽酸關鍵雜質A-1。本方法制備的雜質A-1 純度高，可直接用于建立奧貝膽酸原料藥的質量標準和相關雜質分析。