地塞米松對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病模型的作用及機制

靳珅，劉菲，王昱堃，劉博，譚文

(1.廣東工業大學生物醫藥學院，廣東廣州510006；2.廣州禾信儀器股份有限公司，廣東廣州510006;3.廣東省麥思科學儀器創新研究院，廣東廣州510006)

銀屑病是一種病因復雜且預后不良的慢性炎癥性皮膚病，嚴重時可累及多臟器[1-2]。我國銀屑病的患病率占全球1.25 億患者的50%，且近年來有明顯的增加趨勢[3]。臨床上診斷銀屑病的金標準為白色多層鱗屑、剝離后有薄膜現象和篩狀出血。銀屑病皮損部位組織病理學的表現為角化不全或角化過度，棘層增厚，真皮層內毛細血管擴張和炎性細胞浸潤[4-5]。目前針對銀屑病的治療大部分采用糖皮質激素、卡泊三醇、維甲酸及免疫抑制劑結合一些物理方法來進行對癥治療[6]，其中地塞米松作為一種人工合成的皮質類固醇，在重度患者中或對其他治療無效的情況下應用較多，但其具體作用機制仍未十分明確，本文主要闡述了地塞米松對銀屑病的具體干預機制，為臨床用藥提供基礎支持。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料

1.1.1 實驗儀器 FACS Celesta 型流式細胞儀（Becton,Dickinson 生命科學公司）；Centrifuge 5424R型臺式低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；NU-4950E 型CO2恒溫細胞培養箱（美國NUAIRE 公司）；ProCyte Dx 型全自動血液分析儀（愛德士儀器有限公司）；Leica EG1150C型組織包埋機（德國萊卡科學儀器有限公司）；Leica RM2255 型旋轉石蠟切片機（德國萊卡科學儀器有限公司）；ST5020 型多功能染色機（德國萊卡科學儀器有限公司）；Tristar S LB942型多功能酶標儀（德國Berthold公司）。

1.1.2 實驗動物 30只8～11周雌性SPF 級Balb/c小鼠購于廣東省實驗動物中心，生產許可證號SCXK（粵）2013-0002，合格證編號為44007200057513，飼養在溫度為20～25°C，濕度40%～70%的環境中。

1.1.3 實驗材料 實驗所需抗體AF488-anti-mouse-CD3(B284975)、BV605-anti-mouse-CD4(B279163)、V711-anti-mouse-CD25(B101923)、BV510-anti-mouse-IL-17(B263584)、PE-anti-mouse-FoxP3 (B275698)等及試劑購于美國Biolegend 公司；咪喹莫特乳膏購于四川明欣利迪藥業有限責任公司；小鼠IL-17 ELISA試劑盒[EMC008(H).96]購于深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及藥物處理 將30 只8～11 周雌性Balb/c 小鼠按照體質量排序后根據隨機對照表平均分為空白對照（Ctrl）組、咪喹莫特模型（Pso）組、地塞米松（Dex）組，背部脫毛（4 cm×5 cm）后單籠飼養。Pso 組與Dex 組每天用62.5 mg 的5%咪喹莫特乳膏涂抹背部，Ctrl組涂抹凡士林[1,7]。每天灌胃1次，Ctrl組與Pso 組每天灌胃0.2 mL 生理鹽水，Dex 組按照1 mg/(kg·d)（0.2 mL）的劑量給藥。用盲法每天觀察小鼠皮膚狀態，同時進行銀屑病皮損面積與嚴重度指數（PASI）評分[8]。連續觀察8 d，第9 天采集小鼠眼眶血，EDTA 抗凝后用動物全自動血液分析儀測定小鼠五分類血的情況。處死小鼠后，在背部畫九宮格，選取小鼠第五格皮膚組織，經固定、脫水、透明、包埋，切片后進行HE 染色，觀察小鼠皮損部位組織病理表現，并采用銀屑病病理評分系統(Baker)進行評分[9]，同時用Image J 軟件測量表皮厚度。收集各組小鼠脾臟進行稱重并做后續實驗。

1.2.2 流式細胞術測小鼠脾臟中Th17 和Tregs 細胞的比例 研磨小鼠脾臟后，加入紅細胞裂解液制備小鼠脾臟單細胞懸液，取1×106個單細胞加入2 μL細胞激活劑（PMA+Ionomycin+BFA），在37 °C，5%（φ）CO2條件下刺激培養6 h[10]后，收集細胞，用TruStain fcX?冰上孵育20 min 進行封閉。之后進行小鼠脾臟細胞單管染色，首先各脾臟細胞中加入表面抗體CD3、CD4、CD25 冰上染色30 min，用PBS 清洗后進行固定破膜。之后進行染色胞內抗體IL-17、FoxP3，冰上孵育30 min 后用1×Perm 溶液清洗，200目紗網過濾后檢測。

1.2.3 細胞因子測量 取小鼠眼眶血，用肝素鈉抗凝后，2 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液，測小鼠血清中IL-17的含量。

1.2.4 統計學方法 所有數據以表示，采用GraphPad 5.0 軟件進行統計分析，多組間差異采用單因素方差分析，兩組比較用Newman-Keuls 檢驗方法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的皮膚形態學改變

如圖1A，與Ctrl 組相比，Pso 組小鼠出現銀屑病的典型皮膚改變：小鼠背部皮膚發紅明顯，皮膚呈斑塊狀，有大片鱗屑并伴隨丘疹出現；Dex 組有少量銀屑出現，小鼠皮損情況較Pso 組明顯減輕。如圖1B，由PASI評分可以看出，第1～7 天，隨著給藥時間的增加，無論是水腫情況、皮膚銀屑厚度還是疤痕情況，Dex組的評分都較Pso組更低。

2.2 各組小鼠的全身改變

如圖2，與Ctrl組相比，Pso組小鼠體質量明顯降低，脾臟變大，脾指數變大（P＜0.05），Dex 組體質量在第7、8天有回升，脾臟大小和質量明顯降低，脾臟指數下降（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠的皮膚病理學改變

如圖3A 所示，Ctrl 組小鼠背部皮膚從外到內分別為表皮層、真皮層及皮下組織，皮膚層次分明，角質層厚度正常，Pso 組小鼠皮膚角質層內出現Munro微膿腫，表皮層有明顯的角化過度和角化不全，棘層細胞層數變多、棘層肥厚。真皮層內有炎癥細胞明顯，毛細血管擴張，而給予地塞米松后，上述病理情況明顯改善。對小鼠皮膚背部HE 切片進行組織病理學Baker評分，發現Pso組小鼠Baker評分為Ctrl組的7 倍，給予地塞米松后，Baker 評分降低到Ctrl組的5倍，評分降低明顯（P＜0.01）（圖3B）。通過Image J 測量小鼠表皮層的厚度，發現Pso 組小鼠表皮層厚度明顯增加，而Dex 組小鼠表皮厚度明顯降低（P＜0.01），見圖3C。

圖1 各組小鼠的臨床皮膚形態學改變(A)、PASI評分（B）Figure 1 Clinical skin morphological changes(A)and PASI score(B)of mice in each group

圖2 各組小鼠的全身改變Figure 2 Systemic changes of mice in each group

2.4 地塞米松治療小鼠咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮損的血液五分類情況

Pso 組白細胞總數明顯增多，其中較為明顯的是中性粒細胞和單核細胞的增加（P＜0.05），而淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞的含量則差異無統計學意義（P＞0.05）。Dex 組血液中白細胞總量降低，其中以中性粒細胞的降低更為明顯（P＜0.05）。

2.5 地塞米松對咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮損的T細胞分型的影響

如圖5，Ctrl 組小鼠脾臟中Th 細胞（CD3+CD4+）的含量為40%左右，而Pso 組Th 細胞降低到10%左右，Th 細胞減少明顯（P＜0.05）；Dex 組Th 細胞比值恢復到20%（P＜0.05）。其中模型組Th17(CD4+IL-17+)明顯增加，Tregs 細胞（CD4+CD25+FoxP3+）減少（P＜0.05）。而Dex 組Th17 的比例與Pso 組比較差異無統計學意義（P＞0.05），而Tregs細胞比例明顯增多（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠背部皮膚的組織病理學染色Figure 3 Histopathological staining of back skin of mice in each group

圖4 小鼠全血五分類血細胞表達Figure 4 Expression of five kinds of blood cells in mouse blood

2.6 地塞米松對咪喹莫特誘導的小鼠血清中細胞因子IL-17的影響

如圖6，通過咪喹莫特誘導后，Pso 組小鼠血清中IL-17 的含量與Ctrl 組相比明顯增加（P＜0.05），為Ctrl 組的6 倍左右。Dex 組IL-17 的含量為Ctrl 組的2.3倍左右（P＜0.05），含量較Pso組顯著降低。

3 討論

本研究采用咪喹莫特單次給藥7 d 來建立小鼠銀屑病模型，從小鼠皮損部位改變、PASI評分趨勢圖以及皮損部位組織病理學改變以及Baker 評分可以看出，單次給藥7 d可以很好地模擬銀屑病臨床急性期的情況，第8天各項評分下降，說明IMQ 誘導的小鼠銀屑病樣模型有時間窗的限制，可以認為第7 天為疾病發生的高峰期，這與趙京霞等的研究相符[11]。

在實驗中，隨著造模時間的增加，小鼠全身反應癥狀明顯，如毛色發暗、體質量下降、精神萎靡。Pso 組小鼠的脾指數約為Ctrl 組的2～3 倍，說明咪喹莫特可以使小鼠免疫系統失衡，從PASI評分以及組織病理學觀察和Barker評分可以看出地塞米松可以有效緩解小鼠脾臟的腫大，降低自身免疫反應的發生，對銀屑病小鼠有明顯的治療作用。

圖5 流式細胞術測定小鼠脾臟T細胞Figure 5 Determination of T cells in mouse spleen by flow cytometry

圖6 各組小鼠血清中IL-17細胞因子的表達水平Figure 6 Levels of IL-17 in serum of mice in each group

為了探討地塞米松對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損的作用機制，本研究對不同組小鼠全血的白細胞進行了分類計數，發現地塞米松可以明顯降低中性粒細胞的數目，這與組織病理學中Dex 組角質層中由中性粒細胞聚集形成的Munro微膿腫的數目明顯減少一致。進一步研究了不同組小鼠全血中Tregs 細胞的含量，發現地塞米松可以增加Th輔助細胞向Tregs細胞轉化。研究表明，特異性表達Foxp3 的Tregs 細胞作為一種高效的免疫抑制物來抑制自身過敏性反應，在維持機體正常免疫應答中具有重要的意義。文獻報道，給裸鼠轉移缺少Tregs細胞的小鼠T細胞會誘導裸鼠產生多種自身免疫性疾病，Tregs細胞的增多是抑制自身免疫性疾病發生的關鍵因素[13-14]。推測地塞米松的治療作用可能是通過增加Th 細胞向Tregs 細胞轉化而實現的。雖然Dex 組并不降低小鼠脾臟中Th17 細胞的比例，但血液中IL-17 的含量是降低的，IL-17 的降低可能是因為地塞米松降低了血液里中性粒細胞的水平，從而減少了中性粒細胞對IL-17 的分泌，IL-17 的減少又可以負調控多種炎癥因子，進而減少對中性粒細胞的募集和活化，進一步緩解銀屑病的發生[12]。

綜上所述，地塞米松緩解了由咪喹莫特誘導的T 細胞功能紊亂，增加Tregs 細胞的比例，同時降低血液中IL-17 的含量，從而緩解銀屑病樣皮損的情況。本文主要從銀屑病小鼠脾臟Th 細胞的變化層面闡述了地塞米松對銀屑病的干預機制，為臨床用藥提供基礎支持。后續實驗需要進一步明確地塞米松主要是通過具體哪條代謝通路來影響趨化因子和免疫細胞的表達從而來干預銀屑病的發生。