串錢柳間苯三酚衍生物抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性研究

紀翠芳，李歡，曾玉虹，吉訓戀

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院，海南海口570208)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）是導致燒傷感染、術后創傷感染、燙傷樣皮膚綜合征等軟組織感染的主要致病菌[1-2]，具有多重耐藥性、感染率高及致死率高等特點[3]，是醫院感染的重要病原菌之一[4]，所以被稱為“超級細菌”。該類菌株不僅對青霉素類抗生素耐藥，還能在一定程度上對四環素類和大環內酯類等抗生素耐藥[5]，其耐藥性與抗生素的使用劑量呈正相關，尚無有效遏制這一趨勢的藥物[6]。目前臨床上將萬古霉素作為一線抗MRSA 感染的藥物，但由于萬古霉素有較大的腎毒性，而且還有部分金黃色葡萄球菌出現了對萬古霉素中度耐藥甚至完全耐藥的現象[7]，故萬古霉素對MRSA 不是萬能的，尋找新的能抑制MRSA的抗生素迫在眉睫。

串錢柳（Callistemon viminalis），又名垂枝紅千層，系桃金娘科紅千層屬植物[8-9]。鑒于文獻報道桃金娘科植物含有強抗菌活性[10-12]的化學成分，尤其是間苯三酚類化合物，例如廣為熟悉的間苯三酚rhodomyrtone更是具有潛在的抗MRSA活性，最低抑菌濃度（MIC）為0.39 mg/mL[13]。而在Leejae 等[14]的深入研究rhodomytone 對抗生素耐藥病原菌的抗菌機制中，發現rhodomytone 對病原菌的主要作用靶點不在細胞膜和細胞質中，這提示間苯三酚類化合物極有可能對包括MRSA在內的抗生素耐藥病原菌擁有新的作用靶點。因此，本文對串錢柳植物中已分離鑒定的間苯三酚類化合物2,6-dihydroxy-4-methoxyisobutyrophenone（1）和2,6-dihydroxy-4-methoxyisovalerophenone（2）進行抗MRSA 活性評價，并進一步探討其抗MRSA作用機制。

1 材料與方法

1.1 植物與試劑

串 錢 柳(Callistemon viminalis) 15 kg，2018 年4月，采集于海南省海口市，標本號No.20180401。

MTT 噻唑蘭，美國Sigma 公司；叔丁基過氧化氫(t-BHP),成都格雷西亞化學技術有限公司；柱層析硅膠，200～300 目、300～400 目硅膠均為青島海洋化工廠；TLC 預制薄層板（HSGF254），德國Merck 公司；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20：Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden；MCI 樹 脂：CHP20P(75～150 μm),Mitsubishi Chemical Corporation 生產；96 孔細胞培養板，美國CORNING 公司；胎牛血清(FBS)，澳大利亞Gibco公司；青-鏈霉素(P/S),Thermo公司；DMEM培養基，美國Gibco公司；RPMI-1640培養基，德國Biological Industries 公司；DMSO 溶液，美國Sigma 公司；HPLC分析用乙腈,Merck公司；實驗用水由美國Millipore公司純水、超純水系統提供；其他有機溶劑均為國產分析純產品；TLC顯色劑為5%香蘭素乙醇液。

1.2 主要儀器

質譜：Waters 3100 SQDMS(低分辨ESI)；核磁共振譜：Bruker Avance Ⅲ500 型核磁共振儀，δ(ppm)，以氘代試劑殘留溶劑峰為內標；液相色譜與質譜聯用儀：Waters 2695 LC 偶聯Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS，分析色譜柱型號：Waters Sunfire?RP C18，3.5 μm,4.6 mm×100 mm；CO2細胞培養箱(上海力申科學儀器有限公司)；垂直超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；低速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)；MK3 型酶標儀(美國Thermo fisher 公司)；超低溫冰箱(日本三洋SANYO 公司)；FM-500型倒置熒光生物顯微鏡(上海普丹光學儀器有限公司)；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離

串錢柳枝葉15 kg，切斷后用95%（φ）酒精室溫浸泡3 次，每次7 d，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味。將獲到的總浸膏用水懸浮，然后用乙酸乙酯萃取，減壓條件下濃縮萃取液，得到乙酸乙酯部位（825 g）。首先，選用MCI 柱層析處理乙酸乙酯部位，以乙醇-水（50%、70%、95%乙醇）為流動相梯度洗脫，分別獲得組分A、B、C。隨后，采用硅膠柱層析（200～300 目）對組分A 進行處理，正己烷∶乙酸乙酯（10∶1～1∶1,V∶V）梯度洗脫，薄層色譜（TLC）檢測合并，獲到子組分A1～A9。子組分A3經凝膠柱層析處理，甲醇洗脫，得到組分A3A～A3C；接下來對得到的子組分A3B 再進行硅膠（300～400 目）柱層析處理，正己烷∶乙酸乙酯（10∶1～1∶1,V∶V）洗脫，最后獲得化合物1（1.3 g）、化合物2（1.2 g）。

1.3.2 化合物1和2的結構鑒定

化合物1，黃色粉末，ESI-MSm/z211.13[M+H]+，分子式C11H14O4(不飽和度Ω=5)。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δH1.18(6H, d, 6.7 Hz, H-9,H-l0), 3.79(3H,s,CH3O),3.85(lH,sept,6.7 Hz,H-8),5.93(2H,s,H-3,H-5)。13C NMR(125 MHz,CD3OD):δC103.9(C-1),164.1(C-2),92.6(C-3),165.8(C-4),92.6(C-5),164.1(C-6),210.5(C-7),38.7(C-8),18.2(C-9),18.2(C-10),54.4(CH3O)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物1 為2,6-dihydroxy-4-methoxyisobutyrophenone。

化合物2，黃色粉末，ESI-MSm/z225.15[M+H]+，分子式C12H16O4(不飽和度Ω=5)。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δH0.97(6H,d,6.8 Hz,H-10,H-l1),2.25(lH,m,H-9),2.95(2H,d,6.8 Hz,H2-8),3.76(3H,s,CH3O),5.94(2H,s,H-3,H-5)。13C NMR(125 MHz,CDCl3):δC105.2(C-1),163.6(C-2),92.6(C-3),165.7(C-4),94.3(C-5),164.1(C-6),206.4(C-7),52.7(C-8),25.5(C-9),22.8(C-10),22.8(C-11),55.5(CH3O)。以上數據與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物2 為2,6-dihydroxy-4-methoxyisovalerophenone。

1.3.3 體外抗菌活性評價

菌液制備方法：挑取MHA培養皿上單個菌落于10 mL MH 培養液中，搖床160 r/min、37 ℃條件下培養14 h。將待測菌液用MH 培養液適當稀釋，搖均勻后，600 nm 波長、l cm比色皿測定吸光度值A，根據A600吸光度值1 時，對應細菌數量為1×109CFU/mL，將菌液濃度調整至1×106CFU/mL。

1.3.3.1 MIC與MBC測定實驗 化合物1和2分別用DMSO 做溶劑配制成質量濃度為1 mg/mL 的溶液；陽性藥物萬古霉素用DMSO稀釋成1 mg/mL；刃天青顯色劑用雙蒸水配置成100 μg/mL；分別用0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌，存于避光的棕色小瓶，4 ℃儲存。二倍稀釋法將最終樣品濃度與萬古霉素的濃度依次為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.12 μg/mL、1.56 μg/mL、0.78 μg/mL、0.39 μg/mL、0 μg/mL，然后將96 孔板在37 ℃下孵育18 h。通過顏色的變化來判斷藥物抗菌的MIC 值。根據2013 年CLSI 藥敏實驗規定，能夠殺死大于99.9%初始細菌含量的最低藥物濃度即為MBC 值。在讀取MIC 值后，分別移取各組藥物陰性孔（藍色生長孔）液體少許后用培養基，稀釋一定倍數，取50 μL稀釋后的菌液，涂菌棒均勻涂布于預先制好的MHA瓊脂平板上，將平板于37 ℃恒溫培養箱培養24 h；取出平板讀取菌落個數，計算對應孔內細菌數量，確定MBC值。

1.3.3.2 Time-killing 曲線考察 取稀釋好的菌液（106～107CFU/mL）1.8 mL 于24 孔板中各個孔中，然后配制好的不同濃度化合物、萬古霉素和DMSO（陰性對照）與菌液于37 ℃培養箱中孵育。在0 h、2 h、4 h、8 h、24 h分別吸取100 μL混合液，以MH為稀釋液，連續稀釋10倍稀釋，吸取稀釋后的菌液各5 μL，無菌接種環將菌液平鋪開來涂布于預先制好的MHA 瓊脂培養基平板上，將平板于37 ℃恒溫培養箱培養24 h；取出平板讀取菌落個數；以時間為橫坐標，細菌數量對數值為縱坐標，繪制殺菌曲線，分析其動態殺菌效應。

1.3.4 抗菌機制探討

1.3.4.1 細胞膜去極化實驗 37 ℃，取培養至對數期的菌液，于4 000g，離心10 min，收集細胞，緩沖液洗滌3 次，制備A600為0.1 的菌懸液。將染色劑DiSC3-5加入細胞懸液中孵育，使染色劑終濃度為1 μmol/L，于30 ℃黑暗條件下培養20 min，直至吸收DiSC3-5。然后添加100 mmol/L KCl 溶液以平衡細胞質和外部K+濃度。最后分別指定濃度的化合物，調零對照組Hepes緩沖液組，熒光分光光度計讀數。激發波長λex=660 nm、發射波長λem=675 nm。

1.3.4.2 SYTOX Green 實驗 核染色劑SYTOX Green用DMSO 配制成為濃度為3 mmol/L，避光保存于-20 ℃冰箱。陽離子核酸染料SYTOX Green 其本身基本不發出熒光，與核酸結合，能夠發出強熒光，相當于自身發熒光強度的500倍。細胞膜受損時其細胞膜通透性發生改變，SYTOX Green 核酸染料能夠輕易穿透細胞膜。而活的細胞細胞膜功能完好，可以阻擋核酸染料。死細胞用SYTOX Green染色孵育一段時間，在488 nm 激發下發出熒光，SYTOX Green 熒光染色的方法可用于鑒定細胞懸浮液中的死活及總數。37 ℃，取培養至對數期的MRSA 于4 000g，離心10 min，收集細胞，用0.85% NaCl 緩沖液洗滌3 次，制備A600為0.2 的菌懸液，將其分別與8×MIC 濃度的化合物共同孵育，10 μg/mL 的蜂毒肽作陽性對照，與終濃度為3 μmol/L 的SYTOX green染料共同孵育5 min 激發波長λex=504 nm、發射波長λem=523 nm測量熒光。

1.3.4.3 掃描電鏡實驗 取培養至對數期的菌液于4 000g，離心10 min，收集細胞，用緩沖液（0.85%NaCl）洗滌3 次，制備A600為0.2 的菌懸液，37 ℃下用分別用8×MIC 的化合物溶液處理4 h。將細胞洗滌2 次，懸浮在PBS 中，并在含有2%戊二醛和2.5%多聚甲醛的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）中過夜處理。用PBS洗滌6次后，將樣品在1%四氧化鋨中固定2 h。再用PBS 洗滌3 次后，將樣品通過分級乙醇（50%開始至100%）系列脫水，然后進行冷凍干燥至樣品中的脫水劑徹底揮發干凈。離子濺射法涂金，在掃描電子顯微鏡上拍照觀察。

2 結果

2.1 MIC與MBC測定結果

化合物1 和2 對MRSA JCSC4474 的MIC、MBC值見表1。

2.2 Time-killing曲線考察

結果如圖1 所示，當分別用化合物1 和2 的8 倍MIC 濃度作用于MRSA JCSC4474，測試菌的存活量隨著時間的增加迅速減少，并在24 h 后降到極低點。

表1 化合物1和2對MRSA的MIC和MBC值Table 1 MIC and MBC of compounds 1 and 2 against MRSA

圖1 化合物1和2對MRSA JCSC4744的致死曲線Figure 1 Time-killing assay of MRSA JCSC4744 by compounds 1 and 2

2.3 抗菌機制探討

2.3.1 細胞膜去極化實驗

結果如圖2 所示，經化合物1 和2 作用后，DiSC3-5探針的熒光強度明顯增強，呈現劑量濃度依賴性增大，表明化合物1 和2 在發揮抗菌活性時，會導致細菌細胞膜電勢去極化。

2.3.2 SYTOX Green實驗

實驗結果如圖3 所示，陽性對照熒光信號明顯升高；化合物1 和2 隨著作用時間的增加，熒光信號強度也隨之增加，但作用效果不如陽性對照明顯。

2.3.3 掃描電鏡實驗

結果如圖4a和圖4b所示，化合物1和2處理4 h后，細菌形態出現菌體大小不均，部分細菌破裂、變形，細菌表面出現皺縮等現象。

圖2 DiSC3-5探針下，化合物1 和2 對MRSA JCSC4744 細胞膜去極化Figure 2 Cytoplasmic membrane depolarization assay of MRSA JCSC4744 with compounds 1 and 2 by DiSC3-5 probe

圖3 化合物1和2對MRSA JCSC4744 的SYTOX green試驗Figure 3 SYTOX green assay of MRSA JCSC4744 with compounds 1 and 2

圖4 掃描電鏡下，化合物1（a）和2（b）作用MRSA JCSC4744 4 h后細菌細胞形態圖Figure 4 Cell morphology of MRSA JCSC4744 treated with compounds 1(a)and 2(b)for 4 h by scanning electron microscope

3 討論

隨著抗生素的使用[17]，萬古霉素的MIC 值呈現逐年上升的趨勢，以致出現“MIC 漂移”的現象，為了減少耐藥菌株的出現，亟需尋找新的能抑制MRSA 的抗生素。研究報道，桃金娘科植物特征性化學成分間苯三酚類化合物具有顯著的抗MRSA活性。因此，從該科植物中尋求抗MRSA 先導化合物具有重要意義。而目前很多研究只是針對植物粗提物的抗菌活性，對單體化合物的活性研究尚少，本研究在對桃金娘科植物串錢柳的研究中，分離鑒定得到2 個間苯三酚類化合物，結構鑒定為2,6-dihydroxy-4-methoxyisobutyrophenone(1)、2,6-dihydroxy-4-methoxyisovalerophenone(2)。

化合物1 和2 的MIC（表1）與Time-killing 曲線結果（圖1）顯示，化合物1和2對MRSA JCSC4474的MIC/MBC 值分別為25/50、6.25/100 μg/mL；且在24 h內化合物1和2對MRSA均有持續殺菌效果，并與濃度成劑量依賴關系，因此化合物1和2對MRSA的殺菌效應是迅速且徹底的。在細胞膜去極化實驗中（圖2），DiSC3-5探針的熒光強度明顯增強，表明化合物1 和2 在發揮抗菌活性時，會導致細菌細胞膜電勢去極化，據此推測化合物是通過破壞膜結構而發揮抑菌活性的。在SYTOX Green 實驗中（圖3），盡管熒光信號強度增加不大，但仍可推測化合物1和2是通過作用于細菌細胞膜而發揮抗菌效應。據此，細胞膜去極化實驗和SYTOX Green實驗結果揭示該2 個化合物的抑菌機制是通過破壞細菌的細胞膜而發揮抑菌活性的，同時該結果得到掃描電鏡實驗的驗證。

綜上所述，可知串錢柳植物中的間苯三酚類化合物擁有潛在的抗MRSA 活性，值得深入系統研究該類化合物，并從該類化合物中篩選出抗MRSA 活性更強的先導化合物。本研究還豐富了串錢柳植物的化學成分研究以及豐富間苯三酚類化合物的結構類型，也為天然抗MRSA 藥物研發提供科學依據和物質基礎。