透明質酸受體陽性精子質量特性及對IVF-ET結局影響及預測的研究

楊旭輝，吳遠菲，梁嘉穎，陳柳青

（廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科，廣東廣州510080）

透明質酸(hyaluronic acid,HA)是一種長鏈的多糖結構, 主要分布在肺、腎及生殖系統的疏松結締組織，與透明質酸結合蛋白(hyalur onic acid binding protein,HABP)特異性結合后與細胞外基質結合發揮作用，提高細胞外結構穩定。其對卵母細胞、精子生理活動及受精過程也發揮重要的作用。HA 主要以受體HABP-配體的方式與人、兔、牛精子結合,促進精子獲能、精子活力、受精能力及頂體反應。嚙齒類、牛及人成熟后期的精子表面已發現透明質酸結合蛋白，而且至少2 個特異的能與透明質酸結合的蛋白位點，使精子能夠與卵細胞透明帶結合，從而實現穿透與受精[1-4]。不成熟的精子頭部缺乏HA 受體,不具備與HA 結合的能力。Gabor 等[5]證明能與HA 結合的精子成熟度高,已完成質膜重構、胞質膨出、核組蛋白與魚精蛋白的置換等一系列過程,形成膜外HA 結合位點;若成熟過程障礙則可導致精子頭部HA 結合位點的缺失[6],影響精卵識別而導致受精障礙。由此可見HA 精子代表一群成熟度高、各項功能完備的精子群。王金香等[7]研究顯示,精子-透明質酸結合率＜65%時,總受精率和正常受精率均顯著降低, 建議即使精液常規參數正常, 也應謹慎選擇體外受精(IVF)。Ye 等[8]研究表明, 精子-透明質酸結合率與精子的前向運動率和正常形態率高度相關, 可進一步反映精液質量。牟萬宏等[9]證實，精子-透明質酸結合率≥65%的原因不明性不孕患者的人工授精周期妊娠率高于精子-透明質酸結合率＜65%的患者，提示使用與HA 結合的精子實施人工授精能獲得更好的結局。

精子-透明質酸結合試驗(hyaluronan binding assay,HBA)作為一種簡便易行的評估活動精子成熟度的功能檢測方法,但其獨立或聯合其他指標對于受精能力、胚胎發育潛能及流產的預測卻仍存在爭議。本研究通過比較HBA 正常組和HBA 異常組間的精液各項參數以及受精、胚胎發育及妊娠結局,探尋HBA 獨立或聯合其他指標對IVF 受精、胚胎發育及結局的預測價值,從而更好地指導臨床。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

WLJY-9000型計算機輔助精子質量分析儀(CASA)購自北京偉力；HBA、DNA 碎片檢測試劑盒均購自深圳市博銳德生物科技有限公司；精子形態diff-quick 快速染色試劑購自廣州展成生物科技有限公司。

1.2 標本來源及分組

2017 年1 月-12 月在廣東省婦幼保健院生殖中心取卵行IVF-ET 的患者，納入標準：①排除卵子未成熟或異常導致的受精失敗；②排除女方卵巢低反應;③精液常規檢查示前向運動(progressive motility,PR)精子總數≥15×106,正常形態率＞1%。依照WHO技術規范采集、處理和檢測精液標本。完全液化后分別檢測常規精液參數、DNA 碎片、形態和以固相HA 法檢測透明質酸結合率。按照透明質酸臨界值58%將患者分為A 組(＜58%)和B 組(≥58%)。本研究經醫院倫理委員會批準,且患者知情同意。

1.3 研究方法

1.3.1 HBA、精液常規、正常精子形態率、DNA 碎片率分析 115 份新鮮精液標本，以CASA 檢測精液常規，HBA（精子-透明質酸結合率）按試劑盒說明書檢測，在包被有透明質酸的載玻片上加入液化的精液10 μL，蓋上蓋玻片，20～30 ℃條件下反應10 min，顯微鏡20×10 觀察并計數500 條活動精子，記錄精子尾部持續鞭打但頭部被結合至玻片表面活動受限(與透明質酸結合)的精子數量，計算HBA 率。HBA(%)=100%×與透明質酸結合精子數/計數的活動精子總數,分析HBA 結果與精子密度的相關性；以Diff-Quik 染色法染色，按照WHO 形態學判斷標準檢測精子正常形態率。精子核染色質擴散法檢測每份標本的精子DNA 碎片水平:將含10×106/mL精子的易熔凝膠覆蓋在包被有固態凝膠的載玻片上，經變性、脫核、脫水、染色處理后，顯微鏡下觀察計數500 條精子，計算存在DNA 碎片的精子百分率。精子DNA 碎片率(%)=100%×存在DNA 碎片精子數/計數的精子總數。

1.3.2 IVF-ET 過程GnRH-a 長方案和拮抗劑方案GnRH-a 長方案：黃體中期，皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑醋酸曲普瑞林（達菲林）1.25 mg 行垂體降調節，約14 d 左右達到降調標準后[內膜厚度＜5 mm、E2＜50 pg/mL，FSH(卵泡刺激素）和LH均＜5 U/L]，根據患者年齡、AFC（竇卵泡數）、bFSH 和黃體生成素(LH)值決定肌注果納芬/麗申寶/HMG 的起始劑量，根據卵泡生長情況及E2+孕酮+LH 水平調整用藥。當卵泡直徑≥18 mm時，當晚肌注人絨毛膜促性腺激素HCG4 000～10 000 IU，34～36 h后取卵。精卵共孵育16～18 h，觀察受精情況(僅2PN 是正常受精)，正常受精率=正常受精卵子數/體外受精的總卵子數，受精率=總受精卵子數/體外受精的總卵子數。再次培養48 h 后，觀察胚胎細胞數及碎片比例并評估胚胎質量，選取優質胚胎在B超引導下進行移植。優質胚胎率=大于等于6 細胞優質胚胎個數/正常受精卵源的胚胎總數，可用胚胎率=大于4細胞胚胎個數/正常受精卵源的胚胎總數。拮抗劑方案：月經第2～3 天測量性激素并評估卵巢基礎狀態，進周促排。促排期間，監測陰道B 超及性激素。在卵泡直徑增長至12 mm 以上時，加用GnRH 拮抗劑。待卵泡直徑大于18 mm 時予以絨促性素扳機，夜針后36 h取卵。

1.3.3 血清激素測定 月經周期第2～4 天抽取空腹外周靜脈血3～4 mL 平衡至室溫后3 000 r/min 分離血清，電化學發光法測定FSH、LH和E2。

1.3.4 AFC 計數 月經周期第2～4 天二維超聲觀察雙側卵巢位置、形態，記錄直徑為1～5 mm 的AFC 數(重復測量2～3次)。

1.3.5 統計學方法 采用SPSS16.0 統計軟件。各組計量資料先行正態分布檢驗，組間計量資料比較采用非參數Mann-Whitney 檢驗(非正態)；相關性分析采用spearman(非正態)分析；利用ROC 曲線及二分類logistic回歸分析評價各指標的預測價值。

2 結果

2.1 精液常規、正常形態率、精子DNA 碎片率和透明質酸結合率等相關參數的正態分布檢驗

用SPSS16.0 軟件分別對各組年齡、FSH、AMH（苗勒氏激素）、AFC 計數資料進行正態分布檢驗，顯示大部分為非正態分布。

2.2 HBA 與精子密度、正常形態率和DNA 碎片率的關系

分別比較兩組精子常規、正常形態率和DNA 碎片率。結果顯示，兩組精子密度、DNA 碎片率和正常形態率差異均無統計學意義（Z=-0.741，P=0.459；Z=-0.306，P=0.760；Z=-0.589，P=0.556），見表1。分別對HBA、精子密度、正常形態率和DNA碎片率進行相關性分析，結果發現僅碎片與透明質酸結合率負相關（r=-0.198，P=0.034），密度與正常形態率顯著正相關（r=0.394，P=0.000）。

2.3 IVF-ET女方的基本情況

共納入正常受精的IVF組115例,兩組男方和女方的年齡、不孕年限、BMI、移植胚胎數等比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

2.4 受精及胚胎情況

共納入正常受精的IVF組115例,兩組受精率和正常受精率、卵裂率、正常卵裂率、優質胚胎率和可利用胚胎率差異均無統計學意義（P＞0.05）(表3)。針對透明質酸和受精及胚胎發育進行相關性分析發現與正常受精率正相關（r=0.204，P=0.029）

表1 兩組精子密度、正常形態率和DNA碎片率的比較Table 1 Levels of the sperm density,normal morphology rate and DNA fragmentation rate between two groups

表2 IVF-ET患者基本情況Table 2 Basic situation of patients in IVF-ET

表3 IVF-ET患者受精及胚胎發育情況比較Table 3 Fertilization and embryo development of patients in IVF-ET between two groups

2.5 與妊娠結局的相關性分析

HBA、DNA 碎片、正常形態率、密度和男方年齡預測臨床妊娠的ROC 曲線下面積AUC1、AUC2、AUC3、AUC4、AUC5分別為0.512、0.435、0.494、0.488、0.335。僅透明質酸結合實驗AUC大于機會參考線下面積(P＜0.05)，但是預測效果并不顯著（圖1），經過logistic 回歸分析，求得HBA、DNA 碎片和男方年齡的log(P)值，log(P)=4.000-0.099×男方年齡-0.001×透明質酸-0.001×DNA 碎片。針對該值進行早期流產的聯合預測，求得ROC 曲線下面積為0.661，預測價值較為顯著，其中log(P)的預測臨界值0.485 4，靈敏度83.1%，特異度54.0%，見圖2。

2.6 早期流產的預測

HBA、DNA碎片、正常形態率、密度、男方年齡預測早期流產的ROC 曲線下面積AUC1、AUC2、AUC3、AUC4、AUC5分 別 為0.482、0.580、0.592，0.610、0.725。除了透明質酸各指標的AUC均大于機會參考線下面積(P＜0.05)，但是預測效果并不顯著，見圖3。經過logistic 回歸分析，求得HBA、DNA 碎片和男方年齡的log(P)值，log(P)=-7.011+0.134×男方年齡+0.008×透明質酸+0.022×DNA 碎片。針對該值做早期流產的聯合預測，求得ROC 曲線下面積為0.730，預測價值較為顯著，其中log(P)的預測臨界值0.294 9，靈敏度66.7%，特異度24.5%。

圖1 透明質酸結合實驗，DNA 碎片率、正常形態率、密度和男方年齡預測臨床妊娠的ROC曲線分析Figure 1 ROC curves of HBA,DNA fragmentation rate,normal morphology rate, density and male age in predicting clinical pregnant rate in IVF-ET

圖2 HBA、DNA 碎片率和男方年齡聯合預測臨床妊娠的ROC曲線分析Figure 2 ROC curves of HBA and DNA fragmentation rate combined with male age in predicting clinical pregnant rate in IVF-ET

圖3 透明質酸結合實驗，DNA 碎片率、正常形態率、密度和男方年齡預測臨床早期流產的ROC曲線分析Figure 3 ROC curves of HBA, DNA fragmentation rate, normal morphology rate, density and male age in predicting clinical early abortion rate in IVF-ET

圖4 透明質酸結合實驗，DNA 碎片率和男方年齡聯合預測臨床早期流產的ROC曲線分析Figure 4 ROC curves of HBA, DNA fragmentation rate combined with male age in predicting clinical early abortion rate in IVF-ET

3 討論

輔助生殖技術的發展，對配子的功能檢測要求越來越高，傳統的檢測方法如常規、形態、抗精子抗體等準確反映精子受精能力有限，精子受精功能相關檢測相當復雜，受限于實驗材料的獲取、實驗條件的精準控制以及結果是否準確反映在體功能，例如誘發頂體反應、精卵透明帶結合實驗等。因此，目前的功能檢測更偏向于尋找一些反映精子某項功能的相關標記物，通過檢測標記物來間接反映精子某項功能。

透明質酸是人卵母細胞和透明帶黏液基質的主要成分，精子在成熟的后期可獲得與透明質酸特異性結合的能力，并且精子至少產生2 個特異的能與透明質酸結合的蛋白位點，使精子能夠與卵細胞透明帶結合，從而實現穿透與受精。透明質酸結合實驗就是在體外模擬這一過程，從而實現精子頭部透明質酸受體的鑒定和量化，間接反映精子成熟度，是精子質量評估的新方法。這一新方法是否優于傳統精液常規形態等檢測指標，是否具有預測受精、胚胎發育及妊娠結局的潛能是本研究關注的問題。

本研究分兩部分，一部分體外檢測HBA，對具有透明質酸受體精子的密度、正常形態率和DNA 碎片進行了檢測與比對。研究結果未發現精液標本透明質酸結合率與精子正常形態率和密度的相關性，但是與碎片呈較強的負相關性。

精子形態是評價精子質量的常規指標之一，也是影響受精的重要環節。Prinosilova 等[10]研究證實可與透明質酸結合的精子，其正常形態率比原始精液精子提高了3.04 倍(95%CI:1.9-4.7)。劉瑜等[11]也持同樣的觀點，本研究未發現HBA 與精子正常形態率的相關性，可能有3 個因素：（1）是否受所選取的樣本總體有關。（2）透明質酸結合實驗結果準確性受實驗過程的約束，在時間的把握上有些難，稍微遲一點觀察，本來已經黏附的精子就已經游離變成陰性了，使得研究結果很難做到質控和統一。（3）這個指標單一作為篩選優質精子的特異性和敏感性還有待于進一步商榷。也有研究[12]證實HA 結合精子的形態超高倍放大后并不具有優勢，可能與評估標準不同有關。環境中的活性氧、精子生成過程中染色體的異常組裝、凋亡均可造成精子DNA 損傷，降低精子受精能力和胚胎發育潛能，從而降低妊娠率，使流產率增高。本研究顯示：精子DNA 碎片與具有透明質酸的精子負相關,提示具有透明質酸結合位點的精子凋亡率較低。HA 與精子發育過程中的細胞凋亡、DNA 碎片化、非整倍體染色體形成以及成熟度等相關性廣為報道。有學者發現，能被透明質酸結合的精子，其DNA 損傷率、核蛋白苯胺藍著色率明顯低于同一原始精液標本[13],從不同角度驗證了有透明質酸受體精子成熟度更好，更易耐受氧化損傷等不良刺激。

本研究進一步收集了115 例患者行IVF-ET 周期，納入研究的兩組女方平均年齡、平均不孕年限、總Gn 用量、平均Gn 使用時間等組間差異均無統計學意義。研究檢測了男方精液的透明質酸結合率，將患者分為結合率正常組和結合率非正常組，比較兩組的受精率、正常受精率、卵裂率、正常卵裂率、優質胚胎率、可利用胚胎和臨床妊娠率是否有差異，同時將透明質酸結合率與上述指標進行相關性分析，結果并未發現兩組有顯著性差異，但是相關性分析發現透明質酸結合率與正常受精率正相關。由于受到精子和卵子來源的制約很難大規模推廣，HBA是用來替代精-卵透明帶結合試驗的檢測方法,是用來評估精子結合透明帶的能力，其結果與常規IVF 受精結局之間的相關性,仍存在爭議。之前的研究文獻[14-15]多通過比較精子-透明質酸結合率與受精率之間的相關性來證明其對于受精能力的預測價值。王金香等[7]研究顯示, 精子-透明質酸結合率＜65%時, 總受精率和正常受精率均顯著降低(P＜0.01)。Ye 等[8]對175 例常規IVF 周期樣本研究發現HBA 結合率與體外受精率顯著相關。而Nijs等[14]研究結果顯示HBA 與受精率并無相關性，但發現HBA 與妊娠率顯著相關。本研究發現其與正常受精率的相關性，證實HBA 結合精子相對受精率高。本研究也發現HBA 與胚胎質量如優質胚胎率和可利用胚胎率之間無相關性，HBA 預測胚胎發育潛能、妊娠和流產的價值也不高，只能與其他反映成熟度的指標連用才具有相對較好的預測價值。與一些研究[15-16]結果一致，Tarozzi 等[15]研究報道HBA 與體外受精率及臨床妊娠率均無相關性。Boynukalin 等[16]研究結果提示HBA 結合率并不能提示臨床妊娠率。HBA 對妊娠和早期流產的單一指標的預測價值很有限，但是HBA 聯合男方年齡、DNA 碎片可以將預測妊娠的概率提高到66.1%。聯合男方年齡和DNA 碎片率對早期流產就有較強的預測價值（75%），與劉瑜等[17]的報道類似，劉瑜等的研究結果顯示HBA 聯合DNA 碎片率可提高對早期流產的預測。

綜上所述，頭部具有透明質酸結合位點的精子，其DNA 完整性更好；HBA 聯合其他指標可有效預測妊娠和流產，但作為單一指標對妊娠及流產的預測價值有限。作為檢測精子透明質酸受體的HBA，可能是評價精子多重質量的潛在指標。