轉錄因子FOXA1 在非小細胞肺癌表達及與臨床病理特征之間的關系

薛興陽，藍永權,2，丁丹丹，吳華振,3，羅志明，趙健，孟江

(1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院胸外科，廣東廣州510095；2.梅州市人民醫院腫瘤內二科，廣東梅州514000；3.廣州醫科大學附屬第六醫院/清遠市人民醫院腫瘤放療科，廣東清遠511518；4.廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006)

目前世界范圍內的惡性腫瘤中，肺癌的發病率和死亡率高居榜首，其發病率占總病例的11.6%，死亡率占總病例的18.4%[1]。在我國，發病率和死亡率排名第一的惡性腫瘤目前也是肺癌[2]，其嚴重威脅著人們的健康，極大地增加了生活負擔。隨著科學技術的發展，新的肺癌治療手段不斷出現，尤其是分子靶向治療藥物的不斷涌現，極大地改善了中晚期患者的生存時間及生活質量[3]。目前新的肺癌分子靶點的發現仍是肺癌重要的研究領域之一。

轉錄因子是一類非常重要的細胞內調控因子，它能與上游特定序列特異性結合，促進或抑制基因的轉錄，從而調節特異性目標蛋白表達[4]。細胞內廣泛存在著多種轉錄因子，各轉錄因子可多樣性地調控其靶基因，并在腫瘤的生長、分化、凋亡、侵襲、轉移及耐藥等多個方面起到至關重要的作用[5]。叉頭框蛋白A1(foxhead box A1,FOXA1)是一種在生長發育、腫瘤發生及轉移中起著重要作用的轉錄因子，它在不同的腫瘤中起著不同的作用[6]。生物信息學等研究顯示FOXA1 可能在肺癌發生發展中扮演著重要角色[7]，但目前研究不多。因此，本研究檢測人非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細胞株及人肺癌組織學樣本FOXA1表達并結合臨床病理特征探索FOXA1 在NSCLC 中的表達及意義，為FOXA1 成為肺癌的治療靶點提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

研究使用的NSCLC 細胞株95C、95D、A549、H460、H1650 及PC9 由廣州醫科大學腫瘤研究所提供。組織標本來源于保存于組織標本庫的2012 年11 月至2014 年12 月在廣州醫科大學附屬腫瘤醫院行連續手術治療的經病理證實的NSCLC 患者的肺癌組織和癌旁組織，選擇組織量足夠研究的病例，所有肺癌患者術前均沒有接受腫瘤治療且有完整臨床資料。本研究所有患者均簽署使用其組織樣本知情同意書。獲取組織后立即置于液氮瓶中保存。最終有43 例患者組織標本納入研究。

RMPI-1640（Gibco，美國）細胞培養；Trizol 試劑(Life technology，美國)提取RNA；逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR 試劑盒(Tiangen 有限公司)；PCR 引物設計合成(華大科技有限公司)；鼠抗人FOXA1 多克隆抗體（Santa cruz biotechnology，美國）。CO2細胞培養箱（Thermo Scientific，德國）；ABI 7500 Fast PCR儀(Applied Biosystem，美國)；凝膠成像分析系統、電泳儀及蛋白轉印儀（BIO-RAD，美國）。

1.2 方法

1.2.1 肺癌細胞及肺癌組織標本準備方法 肺癌細胞的培養按常規細胞培養方法進行，將足量生長良好的細胞收集離心后裝入已編號的滅好菌的凍存管中，迅速放入液氮中冷凍，后將標本轉移存放入-80 ℃的深低溫冰箱中保存并做好登記備用。肺癌組織采集首先觀察大體標本，確認腫瘤的位置、大小，同時注意鑒別周圍組織和壞死組織，手術標本離體后應在最短的時間內取材(＜30 min)，把癌和癌旁組織切成直徑為0.5 cm 左右的組織塊，裝入已編好號的滅菌凍存管內，迅速放入液氮中冷凍，后將標本轉移入標本盒存放在-80 ℃深低溫冰箱中長期保存并做好登記備用。

1.2.2 RT-PCR 反應 Trizol 提取細胞及組織總RNA，紫外線分光光度計測量RNA 的濃度及純度，瓊脂凝膠電泳實驗確定RNA 無明顯降解。引物由華大科技有限公司合成，引物序列：GAPDH 上游：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTG-3′，下游：5′-AGGGCC ATCCACAGTCTTC-3′；FOXA1 上 游：5′-AGGGCTG GATGGTTGTATTG-3′；下 游：5′-AGGCCTGAGTTC ATGTTGCT-3′。20 μL 反應體系，反應條件：預變性95 ℃15 min，95 ℃10 s ，60 ℃30 s，40 cycle。內參選GAPDH cDNA，用2-△△CT法分析RT-PCR 的結果。實驗重復3次。

1.2.3 Western blot 實驗 預處理好的研缽中研磨組織，置入EP 管中加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻，冰上超聲波裂解后放在4 ℃搖床上搖0.5 h，13 000 r/min 離心機離心15 min，上清即為提取的總蛋白，置入新的EP 管；BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按45 μg 蛋白質上樣量，積層膠及分離膠分別以80 V 及120 V 恒壓電泳；用濕轉法將蛋白從SDS-PAGE 轉到PVDF 膜上，用6%的脫脂奶粉室溫封閉2.5 h；加入一抗4 ℃孵育過夜，在水平搖床上用TBST 洗膜3 次，每次洗膜15 min；之后熒光二抗在室溫孵育1～2 h；再次在水平搖床上用TBST 洗膜3次，每次洗膜15 min。在暗室內發光，用GAPDH 蛋白作為內參照，目標條帶灰度值采用凝膠圖像分析軟件分析。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 及GraphPad Prism 6 Demo 軟件完成。計量結果用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，定性資料組間比較應用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXA1 mRNA在NSCLC細胞株中的表達

用RT-PCR檢測各肺癌細胞株中的FOXA1表達。結果顯示FOXA1 的mRNA在不同的NSCLC細胞株中有不同程度的表達，在H460細胞中表達最高，在95C細胞表達最低，在H460細胞的表達量是95C細胞的109倍，95D細胞的表達量是95C細胞的2.3倍（圖1）。

2.2 FOXA1 mRNA 在NSCLC 組織中的表達及其與不同臨床病理特征之間的關系

檢測43 例NSCLC 癌組織同癌旁組織中FOXA1 mRNA 的表達，其中C 為NSCLC 組織，NC 為癌旁組織。結果顯示在NSCLC 癌組織中FOXA1 mRNA 的表達為0.731 1±0.095 26，在癌旁組織的表達則為0.485 6±0.055 68，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。通過分析PCR 結果將患者分為FOXA1 mRNA 高表達組和低表達組，分析其表達與NSCLC患者臨床病理資料之間的內在關系。結果顯示FOXA1 mRNA 在NSCLC 癌組織內的表達和年齡相關，在年齡大于55歲患者中的表達明顯低于小于等于55 歲患者的表達（P＜0.05），與患者性別（P=0.331）、吸煙史（P=0.639）、家族史（P=0.641）、病理類型（P=0.362）、腫瘤大小（P=0.571）及淋巴結的轉移（P=0.904）無明顯相關（表1）。

2.3 NSCLC 癌組織中FOXA1 蛋白的表達及其和不同臨床病理特征之間的關系

圖1 FOXA1 mRNA在不同NSCLC細胞株中的表達Figure 1 Expression of FoxA1 mRNA in different non-small cell lung cancer cell lines

43 例NSCLC 癌組織中有3 例提取到的組織蛋白不能滿足Western blot 實驗條件。結果顯示40 例NSCLC 患者癌組織與癌旁組織中的FOXA1 蛋白表達無明顯差異（圖3）。通過分析Western blot結果將患者分為FOXA1 蛋白高表達組和低表達組，分析其表達與NSCLC 患者的臨床病理資料之間的關系。結果顯示FOXA1 蛋白與性別（P=0.592）、年齡（P=0.199）、吸煙史（P=0.5）、家族史（P=0.204）、病理特征（P=0.533）、腫瘤大小（P=0.273）、淋巴結的轉移（P=0.649）無明顯相關。

3 討論

圖2 FOXA1 mRNA在NSCLC癌及其癌旁組織中的表達Figure 2 Expression of FoxA1 mRNA in NSCLC and its adjacent tissues

表1 NSCLC 組織中FOXA1 mRNA 的表達與臨床病理特征的關系Table 1 Correlation between FoxA1 mRNA expression and clinicopathological characteristics of NSCLC

FOXA1 作為FOXA 家族3 個成員中最早被發現的一員，也是目前研究較多的FOXA 成員。FOXA1基因定位于人染色體14q21.1位點上，其結構包括N端的轉錄激活域，中間和DNA 相結合的FOX 域，C端和H3/H4 組蛋白相關的激活轉錄結合域[8]。FOXA1 常被稱為先鋒轉錄因子，它可通過取代組蛋白H1及二甲基化H3賴氨酸4和DNA基因組去甲基化從而使與之相結合的致密染色質區域打開來協助其他轉錄因子激活下游基因表達[9]。研究表明多種癌癥中存在FOXA1的表達，但是在不同的腫瘤中其作用各不相同[10-12]。有研究報道86例肺腺癌的寡核苷酸芯片顯示，在37%（32/86）的分析腫瘤中，FOXA1 mRNA 的 表 達 升 高，在5 例FOXA1 高 表 達肺腫瘤組織中，有2例檢測到其基因擴增，提示該基因在肺癌發生中具有潛在的致癌作用[13]。Sakaeda等[14]研究顯示FOXA1 在所有的小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、肺典型類癌病理類型的免疫組化檢查結果均呈陽性。另有研究報道鱗狀細胞癌標本中FOXA1 陽性率為34.7%，與腺癌標本中的39.6%相當，對于腦轉移，鱗狀細胞癌組織中FOXA1的表達（55.6%）略高于非匹配原發性鱗狀細胞癌組織（43.4%），結果顯示鱗狀細胞癌中FOXA1 的表達與遠處轉移及不良生存率相關（P=0.039）[15]。有學者研究顯示NKX2-1 轉錄因子是人類肺腺癌中擴增最顯著的基因，是正常肺發育的調節因子，NKX2-1可以與叉頭盒轉錄因子FOXA1 協同調控LMO3基因的表達，提示FOXA1可能在肺癌的發生發展中也起到調節作用[16]。Zhu 等[17]在體外和體內實驗均表明，異位穩定表達的miR-194 抑制NSCLC 細胞的增殖、遷移、侵襲和轉移，并誘導細胞凋亡，這種抑制作用可通過重新引入miR-194 的功能靶點FOXA1而逆轉，表明miR-194 可通過靶向FOXA1 蛋白抑制NSCLC 細胞的增殖、侵襲、遷移及增強化療敏感性。Li等[18]研究發現轉染FOXA1小干擾RNA（siRNA）可降低H-INV A549細胞中FOXA1的表達，導致G0/G1期細胞周期停滯，降低H-INV A549 細胞的侵襲、遷移和增殖能力。上述的系列研究提示FOXA1 可能在肺癌發生、發展中有重要作用。

圖3 FOXA1蛋白在NSCLC組織及其癌旁組織中的表達Figure 3 Expression of FOXA1 protein in NSCLC and its adjacent tissues

本研究發現FOXA1 mRNA 在各肺癌細胞株表達量有顯著區別，高轉移細胞株H460 細胞的表達顯著高于其他細胞，而侵襲能力高的95D 細胞[19]表達量是侵襲能力低的95C 細胞的2.3 倍。本研究檢測了NSCLC 及其癌旁正常組織的手術標本，結果發現FOXA1 mRNA 在NSCLC 組織中的表達高于癌旁組織，而且年輕的患者的NSCLC 組織中的表達明顯高于年長的患者。本研究提示FOXA1 可能在肺癌發生過程中起重要作用，但FOXA1蛋白檢測未發現癌組織和癌旁組織區別及其在不同臨床病理特征間的差異。而也有研究者發現雖然胃癌細胞系中FOXA1 在轉錄水平上的表達高于正常胃細胞系，但在FOXA1 蛋白在胃癌組織中的表達顯著低于正常胃組織[20]。這說明可能存在mRNA 到翻譯之間的調節過程，其中存在相當復雜的機制。由此看來還需要更多的研究才能進一步明確FOXA1 在肺癌發生發展中所扮演的角色。

總之，多數研究及本研究均提示FOXA1在肺癌中可能起致癌基因作用。但是目前相關研究尚少，隨著對轉錄因子FOXA1 在肺癌研究中的進一步深入，它在肺癌發生發展中的作用會越來越明晰，期望其成為肺癌的治療新靶點。