一次性尾靜脈注射大劑量鏈脲佐菌素建立大鼠糖尿病性白內障模型

彭偉康，梁嘉樂，盧銘珊，陳曉佳，丁 航，馬衛列，張志珍* （.廣東醫科大學醫學技術學院；.廣東醫科大學基礎醫學院，廣東東莞 53808）

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。隨著人們生活水平的提高、生活方式及飲食結構的改變，糖尿病的發病率和死亡率逐年上升[1]。2013 年全球有3.82 億人患糖尿病，預計到2035 年糖尿病患病人數將增至5.92 億[2]。中國是全球糖尿病發病率增長最快的國家之一，隨著患病率的上升，糖尿病所帶來的疾病負擔越來越重[3]。糖尿病會伴有心血管疾病、糖尿病腎病、糖尿病白內障、糖尿病神經病等并發癥，其發病率和死亡率高于無并發癥的人群[4-5]。糖尿病主要通過其大血管和微血管并發癥影響患者健康，其中糖尿病性白內障是其重要的并發癥之一[6-7]。因此，建立穩定性好的糖尿病性白內障模型對研究糖尿病白內障的發病機制、預防和治療有著重要意義。目前建立糖尿病性白內障模型常用的方法有注射鏈脲佐菌素(STZ)、注射或者口服D-半乳糖、注射四氧嘧啶等[8]。但利用一次性注射STZ 建立糖尿病性白內障模型的報道甚少，且注射大劑量STZ 伴有較高的死亡率，為此本文旨在摸索利用尾靜脈注射STZ 建立一種死亡率低、成模率高、穩定性好的大鼠糖尿病性白內障模型的實驗方法。

1 材料和方法

1.1.1 儀器 臺式低溫離心機(Beckman 公司)；血糖檢測儀(ONE TOUCH 公司)；7180 型全自動生化分析儀(HITACHI 公司)。

1.1.2 材料 50 只雄性SPF(specific pathogen free)級Wistar 大鼠，日齡為42 d，體質量為160～180 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。STZ 和戊巴比妥鈉購自Sigma 公司；其他試劑為國產分析純。0.22 μm 過濾器購自Millipore 公司；10 號灌胃針購自上海金鐘醫療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養 雄性Wistar 大鼠單獨房間飼養，室溫24～26 ℃，濕度50%，晝夜交替時長12 h，自由進食飲水。水為高壓滅菌水，飼料為SPF 級普通維持飼料(購自廣東省醫學實驗動物中心)，每3 d 更換1 次墊料。

1.2.2 糖尿病性白內障動物模型建立 50 只雄性Wistar 大鼠，適應性飼養1 周后，隨機分為模型組(30只)、枸櫞酸鈉緩沖溶液組(10 只，簡稱緩沖溶液組)和正常對照組(10 只)。造模前1 d 大鼠禁食12 h，模型組腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)后，以60 mg/kg 劑量一次性尾靜脈注射10% STZ 溶液(STZ 溶于0.1 mol/L pH 4.5 枸櫞酸鈉緩沖液中，0.22 μm 濾器過濾，避光保存，現配現用)；緩沖溶液組用2%戊巴比妥鈉麻醉后，尾靜脈注射等量0.1 mol/L pH 4.5 枸櫞酸鈉緩沖液。正常對照組不做任何處理，自由進食飲水，每日觀察大鼠生長情況，并于1、4、8 和16 周末稱量大鼠的體質量。

1.2.3 血糖測定 注射10% STZ 后，于1、4、8 和16周末分別測定不同組的空腹血糖水平。測定前1 d晚上禁食，95%乙醇消毒鼠尾后取靜脈血，用血糖儀測量血糖水平。大鼠空腹血糖＞11.6 mmol/L 視為糖尿病模型建立成功。繼續觀察，直至晶狀體皮質渾濁白內障出現。

1.2.4 血脂測定 注射10% STZ 后，于16 周測定不同組大鼠的血脂4 項。測定前1 d 晚上禁食，后頸椎脫臼法處理大鼠，右心室取靜脈血于5 mL 離心管，室溫放置15 min，4 ℃4 000 r/min 離心10 min，分離血清，-80 ℃保存。采用全自動生化分析儀通過質控，按標準化值標定后開始測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.2.5 晶狀體渾濁觀察 每日觀察大鼠眼睛變化，拍照并記錄渾濁出現的時間。實驗過程中根據晶狀體出現渾濁的程度分為:晶狀體完全透明/未出現渾濁(-)、渾濁出現(+)、渾濁嚴重(++)、完全渾濁(+++)4 個等級[8-10]。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 注射STZ 前后大鼠體質量的變化

造模前(0 周)3 個組的大鼠體質量差異無統計學意義(P＜0.05)；造模3 d 后，模型組大鼠的精神狀態變差，進食量、飲水量、尿量增多，尿液呈爛蘋果味道。正常對照組和緩沖溶液組的大鼠體質量在0～16 周內持續上升，至16 周分別達487.0 和478.2 g；模型組體質量增長緩慢，從4 周開始糖尿病“三多一少”的癥狀逐步明顯，與正常對照組和緩沖溶液組相比，4～16周各階段的體質量比較差異有統計學意義(P＜0.01)。整個造模期間，模型組有2 只大鼠于第1 周時死亡，死亡率為6.7%。造模4 周時，有6 只大鼠空腹血糖＜11.6 mmol/L，從模型組剔除。見表1。

表1 注射STZ 后不同時間Wistar 大鼠體質量的比較 (g)

2.2 不同組大鼠血糖水平

正常對照組和緩沖溶液組大鼠空腹血糖均處于正常范圍(＜11.6 mmol/L)，各階段組間血糖差異無統計學意義(P＜0.05)。造模1 周后，模型組大鼠空腹血糖逐漸升高，與造模前相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。造模16周時，模型組空腹血糖升高至25.3 mmol/L，各階段空腹血糖與正常對照組和緩沖溶液組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

2.3 不同組大鼠血脂水平

造模16 周后，與正常對照組和緩沖溶液組相比，模型組大鼠的血清HDL-C 水平升高(P＜0.05)，而血清TG、TC 和LDL-C 水平則差異無統計學意義(P＜0.05)，見表3。

2.4 大鼠晶狀體渾濁的變化

正常對照組和緩沖溶液組大鼠晶狀體，整個造模期間一直保持澄清透明。模型組大鼠從第5 周開始晶狀體逐漸出現渾濁，且晶狀體渾濁非雙眼同時出現。晶狀體開始出現病變1 周內，渾濁情況加重，1～2 周后出現乳白色渾濁。模型組大鼠晶狀體完全渾濁主要集中在實驗6～9 周，晶狀體渾濁變化見圖1。16 周后共有15 只大鼠出現晶狀體渾濁，成模率達68.2%，見表4。

表2 Wistar 大鼠不同時間的血糖水平 (mmol/L)

表3 Wistar 大鼠16 周后血脂水平 (mmol/L)

表4 Wistar 大鼠不同階段晶狀體混濁程度的發生情況

圖1 Wistar 大鼠晶狀體渾濁變化

3 討論

糖尿病性白內障是糖尿病最常見的眼部并發癥之一，建立糖尿病性白內障動物模型首先要建立糖尿病動物模型，使用STZ 誘導建立糖尿病動物模型被廣泛應用于糖尿病和并發癥的研究，該方法成模率高[8,11]。STZ 的作用機制是通過破壞胰島β 細胞，使胰島素分泌不足導致糖尿病，模型動物在高血糖的基礎上進一步并發白內障，但是該動物模型的誘導成功率受STZ 濃度、給藥途徑、動物年齡、性別及體質量多方面因素的影響，尤其是高劑量的STZ 會引起動物死亡[12]。目前，全世界糖尿病發病以Ⅱ型糖尿病為主。腹腔注射STZ 操作簡單、快速，是建立糖尿病模型的常用方法。已有文獻報道，小劑量連續多次注射STZ 與人類Ⅰ型糖尿病相似，大劑量一次性注射與人類Ⅱ型糖尿病相似，而且一次性尾靜脈注射較一次性腹腔注射成模率更高[13]，但是大劑量注射STZ 一直沒有一個確切規定的范圍。

利用一次性注射STZ 建立糖尿病性白內障動物模型的常用方法是腹腔注射1% STZ，劑量為50 mg/kg[9-10]，但注射1% STZ 建立模型，仍出現較高死亡率，可能與輸液量過多、體循環血容量增加有關，此時大鼠處于麻醉狀態，心率減慢，心容量負荷增加，出現心力衰竭而導致死亡[9,12]。除常用50 mg/kg STZ劑量外，還有使用腹腔注射50～65 mg/kg STZ 劑量，也有使用腹腔注射70 mg/kg STZ 及35 mg/kg STZ 劑量建立模型。綜合考慮實際病情和成模率，本實驗采用以60 mg/kg 劑量一次性尾靜脈注射10% STZ 的方法建立糖尿病性大鼠模型。尾靜脈注射10% STZ 1 周后，大鼠空腹血糖明顯升高，達到17.3 mmol/L，與造模前相比差異有統計學意義(P＜0.01)。造模4 周時，有6 只大鼠空腹血糖低于11.6 mmol/L，糖尿病模型成功率達80%。觀察發現，大鼠血糖穩定升高4 周后，白內障病程進展較快，晶狀體出現病變后1～2周，出現乳白色渾濁，晶狀體完全渾濁主要集中在實驗6～9 周。白內障的發病率也與實驗大鼠的性別、年齡等相關，由于雌鼠的胰島素水平比雄鼠高，有更大的胰島素抵抗效應，為此我們選用體重160～180 g的雄性Wistar 大鼠進行實驗，在糖尿病及白內障模型的建立方面耗時更短，本實驗中糖尿病性白內障大鼠成模率達68.2%。

另外，模型組血脂測定發現，與正常對照組和緩沖溶液組相比，模型組大鼠的血清HDL-C 水平升高(P＜0.05)，而血清TG、TC 和LDL-C 水平則差異無統計學意義(P＜0.05)，這可能是機體存在適應性代償機制，使得HDL-C 出現暫時性代償性升高。

綜上所述，本實驗采用60 mg/kg 劑量一次性尾靜脈注射10% STZ 的方法成功建立大鼠糖尿病性白內障模型。該模型具有糖尿病發病率高、死亡率低、穩定性好，且白內障發病時間較早、成模速度快等優點。后續實驗中，需進一步優化STZ 的劑量，以提高糖尿病性白內障模型的成模率。