腫瘤突變負荷對初診野生型晚期非鱗狀細胞非小細胞肺癌化療效果的影響

林貴南，彭杰文，陳可緒（廣東省中山市人民醫院化療二區，廣東中山528403）

肺癌現今是世界上發病率、致死率以及致畸殘率最高的一種惡性腫瘤，近年來由于環境和人群生活方式改變導致肺癌發生率不斷增高[1]，多數患者確診時病情已發展至晚期，不適合接受手術治療而進行化療[2]。野生型晚期非鱗狀細胞非小細胞肺癌主要采用一線化療，相較于二線、三線化療對患者更為經濟、理想。腫瘤突變負荷(TMB)是近年臨床肺癌治療療效預測和預后評估的研究熱點[3-4]。本研究對TMB與初診野生型晚期非鱗狀細胞非小細胞肺癌化療療效、預后關系進行探討。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2014 年1 月-2018 年12 月在本院進行化療的野生型晚期非鱗狀細胞非小細胞肺癌患者，依據均數抽樣公式，U 為檢驗水準α 對應的U 值，σ 為總體標準差，δ 為容許誤差，依據實驗得出標準差σ=1.06，取α=0.05，δ=0.1，得出樣本量為100，考慮到失訪率以及抽樣誤差在100 人的樣本量基礎上增加20%的樣本數，擴展為120 例。納入標準:(1)均為初診非鱗狀細胞非小細胞肺癌；(2)影像學檢查可見有遠處器官轉移；(3)基因檢測為表皮生長因子受體(EGFR) 常見突變和間變性淋巴瘤激酶(ALK) 融合基因陰性；(4)一線接受培美曲塞和順鉑方案；(5)有化療前組織標本用于TMB 檢測；(6)臨床資料完整。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)腫瘤突變負荷檢測前已接受放療、化療者；(3)妊娠期者。經本院醫學倫理委員會批準，將入組患者按腫瘤突變負荷水平分為3 組，高水平組TMB≥20 mut/Mb(n=25)，中水平組6 mut/Mb≤TMB＜20 mut/Mb(n=47)，低水平組TMB＜6 mut/Mb(n=48)。

1.2 方法

所有患者化療前均利用二代測序方法檢測腫瘤組織標本TMB 水平，具體為:采集患者腫瘤組織標本，采集完成后利用甲醛固定并進行石蠟包埋，然后采用蘇木精-伊紅進行染色，經病理專家判定選取腫瘤細胞含量超過10%組織。同時采集患者靜脈血作為陰性對照，采集8～10 mL 外周血并置于EDTA抗凝管中，然后進行離心，其白細胞沉淀則作為陰性對照。樣本處理完成后進行組織、白細胞DNA 提取，試劑盒購自于Qiagen 公司，文庫制備試劑盒購自于Kapa biosystems 公司，文庫純化和PCR 擴增結束后開始目標基因富集及測序。對DNA 文庫添加標簽并混合樣本，在文庫416 個癌癥相關基因編碼區域以及16 個基因的內含子利用定制生物素型DNA 探針捕獲、雜交，并采用Illumina p5、p7 引物和Kapa biosystems 公司提供的新一代測序文庫擴增高保真熱啟動聚合酶預混液擴增文庫DNA，文庫富集后測序。測序數據采用Trimmomatic25 軟件過濾排除低質量/N 堿基，利用GATK 軟件對單核苷酸變異、插入缺失突變進行分析并剔除常見變異。TMB 由編碼區域單核苷酸變異、插入缺失突變組成，同時剔除原發性肺癌驅動基因突變以及移碼突變、抑癌基因截短突變，并將組織標本和白細胞進行對比剔除種系突變。化療方案為:培美曲塞[齊魯制藥有限公司，國藥準字H20060672，規格0.2 g(按C20H21N5O6計)]500 mg/m2，靜滴，第1 天；順鉑(江蘇豪森藥業集團有限公司，國藥準字H20040812，規格2 mL ∶10 mg)75 mg/m2，靜滴，第1 天；每3 周一療程。首次接受培美曲塞前1 周肌注維生素B121 000 μg，口服葉酸400 μg/d，并于培美曲塞用藥當天、隔天、前1 d 口服地塞米松4 mg，2 次/d。以首次治療時間為觀察起點，對患者以電話或上門形式進行隨訪，末次隨訪時間為2018 年12 月31 日。

1.3 觀察指標

(1)腫瘤突變負荷與患者臨床指標相關性。(2)臨床療效[5]:客觀緩解率(ORR)、無進展生存時間(PFS)和總生存時間(OS)，ORR=(完全緩解(CR)例數+部分緩解(PR)例數)/總例數×100%；PFS 為接受治療開始時間至患者病情進展或死亡時間，OS 為接受治療開始時間至患者死亡、末次隨訪時間。(3)TMB 臨界值。(4)不同水平TMB 與PFS、OS 關系。

1.4 統計學處理

采用統計學軟件SPSS22.0 分析和處理，計量資料采取±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料采取率(%)表示，比較行χ2檢驗。利用Spearman 秩相關性分析TMB 與臨床指標相關性；利用ROC 統計方法計算腫瘤突變負荷的最佳臨界值；Log-rank 檢驗方法比較不同TMB 水平PFS 及OS 時間；Cox 回歸分析TMB 對PFS 及OS 的預后影響。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

高水平組有吸煙史者多(P＜0.05)，見表1。

2.2 臨床療效

高水平組ORR 最高，OS 時間最長(P＜0.05)，見表2。

2.3 TMB 對PFS、PS 的影響

對所有肺癌化療患者年齡、性別、吸煙史、臨床類型、臨床分期、ECOG-PS 評分、家族腫瘤史、TMB 水平等行單因素分析，結果顯示TMB 水平對患者PFS、OS 影響作用明顯(P＜0.05)。多因素Cox 回歸分析顯示高水平TMB 對PFS、OS 預后影響顯著(P＜0.05)，低、中水平TMB 影響削弱，見表3、4。

表1 3 組患者臨床資料的比較 (例)

3 討論

野生型晚期肺腺癌屬于異質性腫瘤，選擇有效療效預測和預后指標對于臨床意義重大。TMB 是目前一直在研究的生物標志物，有利于臨床篩查適合接受免疫治療的患者，促進臨床有效治療[6-7]。因多數晚期癌癥患者無法提供足夠腫瘤組織進行檢測，而液體活檢在臨床腫瘤中已逐漸應用，為TMB 發展提供了良好基礎。當患者體內TMB 水平較高時，腫瘤細胞所產生的新抗原數量、種類增加，從而提高免疫識別概率，同時機體抗腫瘤免疫應答反應被免疫檢查點抑制劑激活使腫瘤細胞殺傷率增加。2019 年NCCN 指南將TMB 檢測列入，快速推動了TMB 在臨床治療中的應用。一項研究表明高水平TMB 與各癌癥類型生存率明顯相關，可提高整體生存率[8]。

本研究結果顯示3 組不同水平TMB 患者其吸煙史比較有統計學意義，提示吸煙可能影響肺癌患者TMB 水平，分析其原因可能與吸煙致使大量誘變劑暴露有關。在Wang 等[9]研究中也指出高水平TMB與吸煙有關。本研究中高水平TMB 患者ORR 明顯高于低、中水平TMB 患者，提示高水平TMB 患者ORR 較低、中水平TMB 患者改善明顯，其原因可能是受TMB 水平和化療響應率之間影響。在非小細胞肺癌臨床治療相關報道中，多個研究均表明高水平TMB 患者ORR、PFS、OS 優于低水平TMB 患者[10-13]，并可提高患者免疫應答。但本研究中PFS 與臨床報道不具有一致性，分析原因認為可能與驅動突變因素影響有關，為進一步對此進行論證可考慮在之后研究中對驅動突變因素進行具體分析。本研究結果顯示，高水平TMB 患者的OS 長于低、中水平TMB 患者，提示TMB 對患者的OS 具有預測作用，可在臨床治療中提示有關治療方案制定。高水平TMB 患者OS更長的原因可能是高水平TMB 患者體內癌細胞產生新抗原較多，因此可被免疫細胞識別可能性大，故而患者在免疫治療中獲益更多，總生存時間隨之延長。有關報道顯示高水平TMB 與臨床預后較好有關，Owada-Ozaki[14]、Devarakonda 等[15]研究指出高水平TMB 是影響非小細胞癌預后的重要因素，可輔助預測免疫檢查點抑制劑療效從而改善患者生存狀況。本研究Cox 回歸分析顯示，高水平TMB 對患者PFS、OS 影響顯著，可見在臨床中對其預后有預測作用。雖然TMB 是一項簡單、容易獲得的臨床標志物，且被證實可用于臨床非小細胞肺癌療效及預后預測，但關于TMB 檢測尚無統一標準，臨床操作中可受腫瘤組織標本數量或質量、檢測時間長、檢測方法、腫瘤組織異質性等因素影響限制其應用。

表2 3 組臨床療效的比較

表3 TMB 水平對患者PFS 的影響

表4 TMB 水平對患者OS 的影響