獻(xiàn)血人群抗-TP ELISA 檢測呈反應(yīng)性S/CO 值ROC 曲線分析

黃伯泉，李仲平，梁浩堅(jiān)，謝君謀，黃愛瓊，鄭優(yōu)榮（廣州血液中心/廣州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510095）

梅毒是由蒼白密螺旋體（TP）感染引起人體多器官和神經(jīng)損害的慢性性傳播疾病，也是血液傳播疾病之一，危害極大[1]。近年國內(nèi)外梅毒感染率呈增長趨勢，美國近十年感染率翻一番[2]，在2019 年國內(nèi)甲乙類傳染病發(fā)病數(shù)報(bào)告中排名第3[3]。無償獻(xiàn)血者中因梅毒抗體呈反應(yīng)性報(bào)廢仍是主要原因之一[4]，威脅輸血的安全[5]。目前，國內(nèi)采供血機(jī)構(gòu)多采用2 種不同廠家的檢測梅毒螺旋體抗體酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒對獻(xiàn)血者進(jìn)行初篩和復(fù)檢，有條件的單位會對全部抗-TP ELISA 不合格者進(jìn)行TPPA 確認(rèn)。國內(nèi)有一些關(guān)于抗-TP ELISA S/CO 值與TPPA的相關(guān)性分析文獻(xiàn)，但對于獻(xiàn)血人群分析案例較少[6]，或只是針對醫(yī)院就醫(yī)人群[7]的分析案例，不同試劑又有不同分析結(jié)果。筆者統(tǒng)計(jì)分析2014-2015 年廣州地區(qū)無償獻(xiàn)血梅毒情況以及對一段時間內(nèi)2 種抗-TP ELISA 試劑篩查呈反應(yīng)性結(jié)果（包括雙試劑、單試劑和灰區(qū)）的吸光度/校準(zhǔn)臨界值（S/CO 值）與其TPPA 確認(rèn)結(jié)果進(jìn)行ROC 曲線分析，對比2 種試劑在本實(shí)驗(yàn)室的檢測能力（靈敏度、特異性），并評估2 種試劑S/CO 值的陽性預(yù)測值，旨在優(yōu)化本地區(qū)TP 抗體篩查策略，提高工作效率以及保障獻(xiàn)血者權(quán)益。另外，探討對所有抗-TP ELISA 呈反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)的必要性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

選取2014 年6 月-2015 年4 月廣州血液中心無償獻(xiàn)血者的全血標(biāo)本，獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前知情同意相關(guān)傳染病檢測項(xiàng)目。標(biāo)本采集為EDTA-K2 抗凝試管，并以3 000 r/min 離心10 min。留取血漿標(biāo)本置-30 ℃冰庫保存。

1.2 主要試劑和儀器

梅毒螺旋體抗體酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑分別是北京萬泰生物技術(shù)有限公司試劑盒（A）、上海科華生物技術(shù)有限公司試劑盒（B）。梅毒螺旋體抗體顆粒凝集試劑盒（日本富士株式會社，TPPA）為確認(rèn)試劑。檢測試劑均經(jīng)國家批檢合格并在有效期內(nèi)使用，實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑說明書要求以及按本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。主要使用儀器為:瑞士哈曼頓公司STAR 8CH 自動加樣儀、FAME24/30 自動酶聯(lián)免疫處理系統(tǒng)；奧地利Anthos 公司酶標(biāo)比色儀340RT；洗板機(jī)；久保田離心機(jī)；孵育箱。以上儀器設(shè)備均經(jīng)過計(jì)量部門檢定校準(zhǔn)合格。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用A 和B 試劑盒對標(biāo)本進(jìn)行梅毒螺旋體抗體篩查，單試劑或雙試劑呈反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行雙試劑雙孔復(fù)核檢測，復(fù)核后單或雙試劑仍呈反應(yīng)性則判讀為TP 抗體不及格，對不及格標(biāo)本進(jìn)行TPPA 確認(rèn)，確認(rèn)陽性即為TP 陽性。本實(shí)驗(yàn)室對試劑判讀S/CO 值下限的10%（即0.9≤S/CO＜1，判讀為反應(yīng)性）設(shè)為灰區(qū)，對灰區(qū)標(biāo)本作為反應(yīng)性標(biāo)本處理，最終所選取復(fù)檢雙孔S/CO 值均值作為統(tǒng)計(jì)資料。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)學(xué)處理，繪制受檢標(biāo)本的工作特征曲線（ROC），利用ROC 曲線確定S/CO 值最佳閾值:計(jì)算出最大ROC 曲線下面積（AUC），約登指數(shù)最大時對應(yīng)S/CO 值即為最佳閾值，95%的置信區(qū)間用CI 表示。計(jì)數(shù)資料用率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。分析2 試劑的靈敏度和特異性，并計(jì)算其對TPPA 確證試驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測值。采用GraphPad Prism 7 對A、B 試劑S/CO 值數(shù)據(jù)繪制直方圖，并對其TPPA+和TPPA-的A、B 試劑組內(nèi)和TPPA+中A、B 組間比較，采用Z檢。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 廣州地區(qū)獻(xiàn)血人群梅毒篩查以及TPPA 確認(rèn)結(jié)果

2014 年6 月-2015 年4 月廣州地區(qū)獻(xiàn)血人群為295 766 例，抗-TP ELISA 檢測呈反應(yīng)性標(biāo)本（包括雙試劑、單試劑和灰區(qū)）為1 103 例（0.37%，1 103/295 766），其中抗-TP ELISA 呈反應(yīng)性的1 103 例標(biāo)本進(jìn)行TPPA 確認(rèn)，確認(rèn)陽性738 例（66.91%，738/1 103），陰性353 例，不確定12 例，2 種試劑檢測與TPPA 確認(rèn)情況見表1，2 種試劑檢測S/CO 值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2、3。

表1 ELISA 抗-TP 呈反應(yīng)性標(biāo)本TTPA 確認(rèn)表

表2 抗-TP ELISA 2 種試劑檢測結(jié)果S/CO 值的比較

表3 抗-TP 2 種試劑檢測結(jié)果S/CO 值與TPPA 確認(rèn)關(guān)系

2.2 2 種試劑檢測結(jié)果S/CO 值比較結(jié)果

2 種試劑ROC 曲線A 試劑靈敏度為0.944，特異性為0.975，AUC 為0.992（95%CI:0.988～0.997，P＜0.01)；B 試劑靈敏度為0.948，特異性為0.972，AUC為0.993（95%CI:0.990～0.996，P＜0.01)，A、B 試劑在S/CO 最佳閾值分別為11.5 和9.05，均可預(yù)測大于95%的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果，見圖1；A 和B 2 種試劑的S/CO 值，TPPA 確證陰陽性之間的S/CO 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01，見圖2。

2.3 A、B 試劑S/CO 值范圍與TTPA 陽性預(yù)測值結(jié)果

A、B 試劑S/CO 值在（5～9.99）和（10～14.99）時陽性預(yù)測值分別為67.9%、52.3%和95.3%、93.2%；當(dāng)S/CO 值≥5 時，A、B 總陽性預(yù)測值達(dá)到95.5%、95.2%。而當(dāng)5≤S/CO≤14.99 時，A、B 總陽性預(yù)測值僅為83.2%、80%，見表4。2 種試劑抗-TP ELISA S/CO 值各段范圍與TPPA 陽性率關(guān)系，見圖3。

圖1 A 和B 2 種試劑S/CO 值ROC 曲線

圖2 A 和B 確認(rèn)TPPA S/CO 值比較

表4 A 和B 檢測結(jié)果與TPPA 陽性預(yù)測值

圖3 2 種試劑抗-TP ELISA S/CO 值各段范圍與TPPA 陽性率關(guān)系

3 討論

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示廣州血液中心無償獻(xiàn)血者梅毒抗體不及格率為0.37%，比本地區(qū)10 年前報(bào)道的0.45%[8]有所降低，低于佛山報(bào)道的0.38%[9]，大大低于商丘的0.55%[10]、北京的0.462%[11]。剔除部分單試劑和灰區(qū)不及格標(biāo)本，廣州地區(qū)獻(xiàn)血人群真實(shí)梅毒感染率會更低，以本文在2014 年6 月-2015 年4 月內(nèi)TPPA 確認(rèn)來計(jì)算只有0.25%（738/295 766），佛山是0.34%[9]。廣州地區(qū)梅毒陽性率比較低的主要原因有:近年不斷加強(qiáng)的獻(xiàn)血宣傳以及單位團(tuán)體獻(xiàn)血動員的力度，其次是嚴(yán)格執(zhí)行獻(xiàn)血前的篩查。雖然ELISA方法的靈敏度高，特異性較好，但會出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性，這不但增加經(jīng)濟(jì)成本，同時加大檢測部門確認(rèn)復(fù)核的工作量，而且假陽性獻(xiàn)血者會被獻(xiàn)血信息系統(tǒng)屏蔽，打擊獻(xiàn)血者的獻(xiàn)血熱情和愛心，給獻(xiàn)血者帶來極大的影響，甚至導(dǎo)致醫(yī)療糾紛，不利于獻(xiàn)血事業(yè)的發(fā)展。TPPA 是目前梅毒公認(rèn)的確認(rèn)試驗(yàn)，但試劑昂貴、操作耗時繁瑣，本文中A、B 試劑S/CO“灰區(qū)”共84 例，TPPA 確認(rèn)全為陰性，顯示抗-TP ELISA 的“灰區(qū)”設(shè)置并沒起到實(shí)質(zhì)作用，反而增加復(fù)核工作量、提高血液報(bào)廢率以及給這部分假陽性獻(xiàn)血者帶來極大影響，但是“灰區(qū)”設(shè)置是否必要以及設(shè)置的范圍，筆者認(rèn)為還要對本次84 例TPPA 確認(rèn)陰性獻(xiàn)血者進(jìn)行復(fù)查后的追蹤查證，而且需要收集更多數(shù)據(jù)論證。不可否認(rèn)“灰區(qū)”的設(shè)置發(fā)揮一定的作用，譚艷等[7]報(bào)道醫(yī)院篩查的3 例0.5≤S/CO＜1“灰區(qū)”樣本，最后TPPA 確診陽性。有文獻(xiàn)報(bào)道ELISA 灰區(qū)設(shè)置在檢測抗-HBV、抗-HCV 和抗-HIV 中發(fā)揮重要作用[12]。另外，國內(nèi)大多采供血機(jī)構(gòu)“灰區(qū)”設(shè)置為0.5≤S/CO＜1[6]，筆者認(rèn)為這是國內(nèi)大部分地區(qū)TP 陽性率高的原因之一。酶聯(lián)免疫吸附檢測雖然在血液篩查中有很多優(yōu)點(diǎn)，但也有容易發(fā)生非特異性反應(yīng)的缺點(diǎn)，假陽性的出現(xiàn)主要是存在內(nèi)源性（類風(fēng)濕因子RF、補(bǔ)體、高濃度非特異性免疫球蛋白和異嗜性抗體等）和外源性（標(biāo)本溶血、放置時間過長和抗凝不全等）干擾因素[13]，也有可能是感染“窗口期”和病毒變異等原因所致[7]。美國CDC 對Ortho 的抗HCV ELISA 試劑盒研究發(fā)現(xiàn)，檢測結(jié)果S/CO 值≥3.8 才有95%以上初篩檢測呈反應(yīng)性標(biāo)本是真陽性，小于3.8的假陽性高；國內(nèi)的某些抗HCV 試劑即更高，個別甚至S/CO 值≥12.0 才有95%的真陽性[13]。本文抗-TP ELISA 的S/CO 值比較中，我們發(fā)現(xiàn)A、B 2 試劑的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），2 種試劑的S/CO 值以TPPA 確認(rèn)分類之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2、圖2，可能與它們包被的單克隆抗原和反應(yīng)體系差異造成的，但是2 種試劑的檢測形成了互補(bǔ)降低假陰性的可能，大大保證血液安全，見表3、表4 和圖3。

2 種試劑ROC 曲線顯示它們與TPPA 確認(rèn)結(jié)果均具有較高的符合度，A、B 試劑靈敏度和特異性比較一致，S/CO 最佳閾值分別為11.5 和9.05，均可以預(yù)測大于95%的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果。這與何芮[6]報(bào)道的萬泰抗-TP ELISA 試劑最佳閾值8.99（即本研究的B試劑）基本一致。根據(jù)表4，我們發(fā)現(xiàn)A、B 試劑S/CO值（10～14.99）時陽性預(yù)測值分別達(dá)到95.3%、93.2%，有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)S/CO 值達(dá)到一定高值時可以取消TPPA 的確認(rèn)[14]直接屏蔽獻(xiàn)血者。因此，筆者認(rèn)為本文中2 種抗-TP ELISA 的S/CO 值均≥10 時，即無需作TPPA 的確認(rèn)，可直接屏蔽這類獻(xiàn)血者。而對于單試劑S/CO 值≥10 或雙試劑S/CO 值均＜10 的均需要進(jìn)行TPPA 確認(rèn)，再給獻(xiàn)血者進(jìn)行結(jié)果反饋和日后追蹤復(fù)查，給這部分假陽性獻(xiàn)血者正名，為日后盡早歸隊(duì)提供保障。

綜上所述，對于“灰區(qū)”不及格獻(xiàn)血者，筆者將繼續(xù)追蹤其復(fù)查檢測數(shù)據(jù)以及收集更多的數(shù)據(jù)以探討獻(xiàn)血者梅毒篩查“灰區(qū)”中是否存在TP 真陽性的問題。潛伏性梅毒、不同梅毒期或者用藥治療后都會影響梅毒血清檢測結(jié)果[15-16]，所以需要嚴(yán)格把關(guān)獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前的體格檢測，同時梅毒的檢測還需要綜合考慮，對于ELISA 不確定結(jié)果還是要做TPPA 確認(rèn)；不同抗-TP ELISA 血液篩查試劑有各自的最佳閾值，抗-TP ELISA 通過最佳S/CO 閾值和陽性預(yù)測值設(shè)定出適合本試驗(yàn)室在用試劑的“總最佳閾值”和使用條件。以上檢測策略在保證檢測質(zhì)量同時能大大提高工作效率以及節(jié)省成本，從而更好地為獻(xiàn)血者歸隊(duì)服務(wù)提供支持。