磁共振pH 成像原理及其在腫瘤酸性微環(huán)境形成機(jī)制及其發(fā)展演變中的研究進(jìn)展

姜煒琪，姜萌，阿榮，孫夕林

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類的生命健康、降低患者生活質(zhì)量，是世界第二大致死原因，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。據(jù)全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)顯示，至2030 年，每年將有1300萬人死于癌癥[1]。自20世紀(jì)70年代以來，中國惡性腫瘤病死率上升了142.85%[2]。腫瘤細(xì)胞會(huì)通過特殊的代謝途徑產(chǎn)生不利于正常體細(xì)胞生存生長(zhǎng)的細(xì)胞外微環(huán)境，同時(shí)會(huì)上調(diào)各種基因表達(dá)和蛋白生物合成以增加其侵襲性和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散能力，導(dǎo)致實(shí)體瘤對(duì)放療、部分化療等傳統(tǒng)癌癥治療方法產(chǎn)生耐受性[3]。準(zhǔn)確診斷腫瘤的病理狀態(tài)對(duì)其早期確診、正確疾病管理、進(jìn)行個(gè)體化治療至關(guān)重要。腫瘤細(xì)胞外酸性微環(huán)境是實(shí)體瘤的特征之一，pH 調(diào)節(jié)機(jī)制是腫瘤細(xì)胞存活的重要組成部分，其逆轉(zhuǎn)可阻止原發(fā)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，能夠非侵入地量化腫瘤細(xì)胞外pH 的工具有極大的可能性進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。磁共振成像技術(shù)由于其非侵入性、無放射性損傷、高空間分辨率和深組織穿透性等前提，具有較高的病理成像潛力，已作為常規(guī)輔助檢查技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床。近年來，科研人員致力于以磁共振成像方法作為技術(shù)核心，研究腫瘤組織無創(chuàng)在體、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、定性定量pH 檢測(cè)的全新評(píng)估手段，以提供腫瘤組織代謝相關(guān)以及分子功能水平的生物學(xué)信息。本文從腫瘤酸性微環(huán)境的形成機(jī)制及其病理生理學(xué)意義出發(fā)，對(duì)目前現(xiàn)有的磁共振pH 成像技術(shù)及方法展開評(píng)述，并針對(duì)其在本領(lǐng)域的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床應(yīng)用現(xiàn)況或臨床轉(zhuǎn)化的機(jī)遇與挑戰(zhàn)進(jìn)行探討，以促使新型磁共振pH成像技術(shù)方法及pH敏感磁共振分子成像探針的設(shè)計(jì)開發(fā)提供理論依據(jù)，并為其臨床應(yīng)用前景及效用評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。

1 腫瘤細(xì)胞外酸性微環(huán)境

與正常體細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH (intracellular pH，pHi)大于7.2，細(xì)胞外pH (extracellular pH，pHe)為6.7～7.1，這種特殊的腫瘤pH梯度稱為“反向pH梯度”，細(xì)胞外酸性環(huán)境是實(shí)體瘤的特征之一。Warburg效應(yīng)表明，即使有充足的氧氣支持線粒體呼吸，腫瘤細(xì)胞也能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化生成乳酸[4]，這種有氧糖酵解的代謝特征低能耗但可快速產(chǎn)生熱量。為避免細(xì)胞內(nèi)酸中毒，腫瘤細(xì)胞會(huì)上調(diào)部分質(zhì)子泵的表達(dá)及活性將質(zhì)子及乳酸釋放至胞外環(huán)境，質(zhì)子泵包括Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+/HCO3-cotransporter，NBC)[5]、液泡H+-ATPases (V-ATPases)[6]、Na+/H+交 換 體(Na+/H+exchanger，NHE)[7]、單 羧 酸 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體(monocarboxylate transporter，MCTs)[8]、碳 酸 酐 酶(carbonic anhydrases，CA)[9](圖1)。

實(shí)體瘤惡性微環(huán)境已成為癌癥患者死亡的主要原因[10]。實(shí)驗(yàn)表明，與pH 為7.4 相比，在pH 為7.0 的條件下進(jìn)行48 h細(xì)胞培養(yǎng)，裸鼠靜脈注射人黑色素瘤細(xì)胞后肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率約增加1 倍[11]，這是由于酸性的細(xì)胞pHe 限制了HCO3-的緩沖作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)力學(xué)活性，進(jìn)而激活酸激活蛋白酶，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[12]。此外，酸性環(huán)境有助于腫瘤化學(xué)抵抗、阻礙機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫排斥、降低部分弱堿性抗腫瘤藥物的治療作用[13]。綜上所述，腫瘤細(xì)胞外pH 的無創(chuàng)在體、定性定量、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)在其臨床診斷、指導(dǎo)治療、療效監(jiān)測(cè)中起重要作用，目前已研發(fā)出部分具有pH 檢測(cè)作用的技術(shù)和方法，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供了全新研究方向。

2 現(xiàn)有腫瘤組織pH檢測(cè)技術(shù)及方法

傳統(tǒng)測(cè)定組織酸堿度的方法主要包括：微電極法，測(cè)量結(jié)果較為精準(zhǔn)但有創(chuàng)；熒光光譜法，可污染組織細(xì)胞[14]；正電子發(fā)射斷層分子成像，可快速觀察機(jī)體整體情況但成本昂貴且有輻射；磁共振技術(shù)，憑借高空間分辨率、無放射損傷、無創(chuàng)實(shí)時(shí)在體等優(yōu)異性能，具有廣闊的腫瘤組織pH 檢測(cè)臨床應(yīng)用潛力。

3 磁共振pH成像技術(shù)

磁共振pH 成像技術(shù)是采用磁共振成像方法來分辨pH 值不同的組織之間成像強(qiáng)度差異，其技術(shù)原理基于以下兩點(diǎn)：(1)pH 依賴以及非pH 依賴共振之間的化學(xué)位移差異來測(cè)量組織pH；(2)使用pH 敏感的對(duì)比劑改變弛豫，進(jìn)而評(píng)估腫瘤細(xì)胞外環(huán)境的pH 變化。磁共振波譜和磁共振波譜成像技術(shù)可準(zhǔn)確無創(chuàng)地進(jìn)行在體pH值測(cè)量[15]，最常用的31P譜技術(shù)即根據(jù)組織代謝產(chǎn)物磁共振頻譜中無機(jī)磷和磷酸肌酸化學(xué)位移的差值，與參考曲線進(jìn)行比較計(jì)算組織的pHi 值[16]，但其時(shí)空分辨率較低，需維持組織長(zhǎng)時(shí)間的生理穩(wěn)定狀態(tài)，臨床應(yīng)用受限。而MRI 技術(shù)可以解決上述問題，成為目前腫瘤組織pH 測(cè)量的主要方法。同時(shí)，隨著磁共振分子成像技術(shù)的發(fā)展，可在活體狀態(tài)下研究及評(píng)估腫瘤酸性環(huán)境的代謝相關(guān)功能分子水平機(jī)制[17]。1H 磁共振成像技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，為減少機(jī)體因質(zhì)子含量豐富所產(chǎn)生的背景信號(hào)，許多pH 成像技術(shù)研究集中在探索除1H 原子外的其他核磁共振原子，以下將介紹13C、19F、1H磁共振pH成像技術(shù)的研究進(jìn)展。

3.1 13C-MR成像

除質(zhì)子外，腫瘤組織pH 值也受碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)控制。13C- 碳酸氫鹽和13CO2的pH 依賴化學(xué)平衡可以使用Henderson-Hasselbalch方程來計(jì)算：

其中，pKa 是離解常數(shù)，在機(jī)體內(nèi)為6.17，超極化13C 標(biāo)記的碳酸氫鹽和CO2信號(hào)與各自分子濃度對(duì)應(yīng)，通過這些信號(hào)的比值可以進(jìn)行pH 值估計(jì)。13C 通過質(zhì)子去耦合和動(dòng)態(tài)核極化(dynamic nuclear polarization，DNP)[18]增加13C 頻譜的敏感性并使其分子信噪比提高。通過構(gòu)建專門的射頻線圈、開發(fā)新脈沖序列進(jìn)行13C 的信號(hào)采集，可以將DNP 技術(shù)應(yīng)用于腫瘤pH 值的檢測(cè)[19]。Ferdia 等[20]通過研究得出，化學(xué)位移成像顯示動(dòng)物體內(nèi)存在超極化的碳酸氫鹽信號(hào)，其中主動(dòng)脈檢測(cè)到的含量最高，而在腫瘤內(nèi)主要發(fā)現(xiàn)了超極化的13CO2，逐體素分析證實(shí)，與周圍正常組織相比，腫瘤pHe呈酸性，此技術(shù)稱為pH mapping，即對(duì)比劑介導(dǎo)的、使用DNP生成增強(qiáng)的碳酸氫鹽比值成像。Hundshammer 等[21]應(yīng)用超極化的[1,5-[13]C2]偶氮酸(ZA)及其衍生物[1,5-[13] C2,3,6,6,6-D4]右旋酸(ZAd)作為新型細(xì)胞pHe MRI 探針，利用DNP 技術(shù)對(duì)MRI 信號(hào)進(jìn)行了10000 倍以上的增強(qiáng)，大鼠皮下MAT B Ⅲ腺癌在體實(shí)驗(yàn)表明，ZA 能夠測(cè)量并區(qū)分腫瘤血管內(nèi)外pH。此外，ZA 的氘化顯著延長(zhǎng)其縱向弛豫時(shí)間并增加靈敏度，可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)pH 變化。然而，由于對(duì)13C 線圈的要求較高以及通過DNP 產(chǎn)生超極化分子的技術(shù)難度較大，阻礙了這種有前景技術(shù)的臨床應(yīng)用，因此研究產(chǎn)生超極化分子的其他途徑有助于該技術(shù)方法早期應(yīng)用于臨床。目前科研工作者正致力于建立一種提供高信噪比和空間依賴性的臨床工具，以允許超極化13C-DNP pH mapping 與磁共振分子成像結(jié)合起來，達(dá)到磁共振成像提供腫瘤組織相關(guān)的高質(zhì)量質(zhì)子加權(quán)圖像，超極化13C 代謝MR 顯示相應(yīng)的生化和pH 值信息的目的[22-23]。同時(shí)，開發(fā)新型MRI 序列進(jìn)行快速圖像采集以及設(shè)計(jì)接收器線圈來改進(jìn)信號(hào)檢測(cè)將允許該技術(shù)達(dá)到亞毫米空間分辨率，對(duì)肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等實(shí)體瘤進(jìn)行高分辨率pH 成像。

3.2 19F-MR成像

19F 天然豐度為百分之百，具有較高的旋磁比，最外層的7 個(gè)電子使其化學(xué)位移對(duì)局部環(huán)境十分敏感。氟元素僅存在于機(jī)體骨骼與牙齒中，使19F 探針有益于腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和追蹤，賦予其進(jìn)行MRI 核素成像的巨大潛力。目前已有研究使用氟化維生素B6 衍生物來研究兔心肌細(xì)胞內(nèi)外pH[24]。19F MRI 功能納米探針的開發(fā)近年來受到了廣泛的關(guān)注，其中pH敏感的19F MRI 探針尤具吸引力。大多數(shù)pH 響應(yīng)性19F MRI 納米探針是含叔胺的氟化聚合物納米顆粒，隨著pH 值的變化，這些聚合物鏈可以通過三級(jí)氨基的質(zhì)子化和去質(zhì)子化而膨脹或收縮，進(jìn)而導(dǎo)致19F-MRI 信號(hào)的激活或消失。Guo 等[25]設(shè)計(jì)了一種pH 響應(yīng)19F MRI 納米探針，命名為FNPs-PEG，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)pH 值從7.4 降低到5.5 時(shí)，19F MRI 的信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，并且荷瘤鼠在體實(shí)驗(yàn)可采集到較強(qiáng)的19F 信號(hào)，說明該探針有望作為啟動(dòng)19F MRI pH 成像的對(duì)比劑。隨著研究進(jìn)展開發(fā)出了多功能19F 納米探針進(jìn)行雙模或多模態(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì)比pH 成像[26]，或使用pH 敏感的19F 探針進(jìn)行雙核或多核素對(duì)比增強(qiáng)成像并采集相應(yīng)信號(hào)用于組織pH 檢測(cè)[27]。氟化探針毒性較低，具有一定的生物安全性，有利于臨床轉(zhuǎn)化，但由于19F-MRS及19F-MRI的檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，因此應(yīng)改進(jìn)掃描時(shí)間、脈沖序列或線圈設(shè)計(jì)來提高檢測(cè)靈敏度并獲得高分辨率圖像。共包埋其他顯像劑和藥物或聯(lián)合其他技術(shù)方法進(jìn)行19F-MR 腫瘤pH 成像，可為多模態(tài)成像和診療一體化研究開辟新的方向，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

3.3 氫質(zhì)子磁共振波譜成像

3.3.1 化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移磁共振成像

化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(chemical exchange saturation transfer，CEST)成像技術(shù)通過飽和特定的可轉(zhuǎn)移質(zhì)子使其與水中質(zhì)子進(jìn)行交換，其對(duì)比度受pH、可交換位點(diǎn)濃度、溫度等調(diào)節(jié)可交換質(zhì)子化學(xué)環(huán)境因素的影響，因此可以通過觀察水信號(hào)的改變進(jìn)而間接獲得pH值空間或時(shí)間分布的對(duì)比成像[28]。

CEST 成像主要分為以下三類：抗磁性CEST (diamagnetic CEST，DIACEST)、順磁性CEST (paramagnetic CEST，PARACEST)和酰胺質(zhì)子轉(zhuǎn)移(amide proton transfer，APT)。DIACEST 對(duì)比劑是包含胺和羥基等化學(xué)基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，Wolff 和Balaban[29]首次證實(shí)，在RF脈沖飽和情況下可進(jìn)行DIACEST成像。PARACEST 對(duì)比劑是鑭系元素和有機(jī)螯合物的復(fù)合物，Pagel團(tuán)隊(duì)[30]開發(fā)了一種新型PARACEST對(duì)比劑Yb-DO3A-oAA，它具有兩個(gè)pH 值響應(yīng)CEST 中心、不同MR 頻率和不同的pH 依賴性，可在不飽和輻射下進(jìn)行量化、減輕SAR 值影響。APT 技術(shù)可以選擇組織內(nèi)源性蛋白質(zhì)及多肽的酰胺質(zhì)子作為飽和目標(biāo)，通過測(cè)量水信號(hào)的變化，間接獲得交換率計(jì)算組織pH[31]，其空間分辨率良好但其時(shí)間分辨率較低，目前主要應(yīng)用于阿爾茨海默癥[32]的研究。

碘類對(duì)比劑具有可交換的氫質(zhì)子酰胺基團(tuán)，由于其極高的生物安全性，已被用于MRI-CEST pH mapping 的臨床試驗(yàn)。Longo 等[33]使用碘比醇(僅含有一套酰胺質(zhì)子且CEST 作用強(qiáng)烈依賴于pH 的對(duì)比劑)選擇性施加不同功率的射頻脈沖并通過比值測(cè)定法獲得不同脈沖功率下的CEST 信號(hào)可檢測(cè)感興趣區(qū)的pH 值。通過實(shí)驗(yàn)獲得其1.5μT(a)和6μT(b)的RF 飽和脈沖下的ST 圖像，通過計(jì)算處理獲得其不同pH 下的pH map(圖2A)。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)腫瘤細(xì)胞pHe 進(jìn)行成像，并在異種移植乳腺腫瘤的小鼠模型中獲得了成功(圖2B)。此外，碘帕醇已被用于提供卵巢癌或乳腺癌患者的腫瘤pHe 成像[34]。以上成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究CEST MR pH 成像鋪平了道路，確認(rèn)了腫瘤pHe mapping 在診斷和療效監(jiān)測(cè)的臨床效用。通過開發(fā)新型CEST MR 成像技術(shù)、提高對(duì)比劑的靈敏性及安全性、減少磁場(chǎng)條件以及掃描序列或組織內(nèi)源性干擾因素的限制，CEST MR 成像技術(shù)有望提供準(zhǔn)確的pH 測(cè)量和多種生物體功能信息，并早期應(yīng)用于臨床腫瘤組織pH 值監(jiān)測(cè)。

3.3.2 MRI對(duì)比增強(qiáng)

pH 響應(yīng)性順磁性釓對(duì)比劑GdDOTA-4AmP5-中膦酸鹽側(cè)臂質(zhì)子化形成的氫鍵可進(jìn)行氫交換，但其測(cè)量結(jié)果高度依賴于每個(gè)成像體素中的試劑濃度，難以直接獲得溶液pH 值[35]。Gillies 等[36]先后注射同劑量的GdDOTA-4AmP5-和GdDOTP5-(后者pH 不響應(yīng))對(duì)腦膠質(zhì)瘤的小鼠腫瘤組織進(jìn)行了pH 成像：假設(shè)兩種藥物具有相同的藥代動(dòng)力學(xué)和組織生物分布，pH不敏感釓劑的分布可以用來預(yù)測(cè)pH 敏感釓劑的濃度，通過對(duì)比灌注后二者的最大信號(hào)強(qiáng)度圖的差異得到pH 圖，但因其費(fèi)時(shí)且這些常規(guī)的對(duì)比劑特異性差，其臨床應(yīng)用潛力有限。

MRI 傳統(tǒng)對(duì)比劑的靈敏度和特異性的相對(duì)不完美促使人們尋找并研發(fā)靶向性和生物安全性更高的磁共振分子成像探針，以腫瘤組織的細(xì)胞外酸性環(huán)境為激活信號(hào)，在腫瘤區(qū)域中激活的納米級(jí)pH 敏感性對(duì)比劑應(yīng)運(yùn)而生[37]，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中展示出了其巨大的潛能與優(yōu)勢(shì)。Mi 等[38]設(shè)計(jì)了一種pH 響應(yīng)的、可迅速放大磁共振信號(hào)的納米對(duì)比探針PEGMnCaP，他們使用pH 敏感的磷酸鈣納米顆粒封裝具有縮短腫瘤周圍氫質(zhì)子T1弛豫時(shí)間的Mn2+。在酸性環(huán)境下，納米包殼裂解釋放Mn2+，選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合并快速增強(qiáng)實(shí)體瘤T1信號(hào)值，精確地成像腫瘤及響應(yīng)其細(xì)胞外酸性環(huán)境的病理狀況。結(jié)腸癌皮下荷瘤鼠的在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH 響應(yīng)的納米探針不僅能夠?qū)δ[瘤部位進(jìn)行特異性成像，而且還可以對(duì)腫瘤組織的pH 進(jìn)行監(jiān)測(cè)。但它們也存在著弛豫率低，體內(nèi)清除率過快且增強(qiáng)效果在成像結(jié)果中不明顯等缺點(diǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建具有高弛豫效率、良好生物相容性、高靶向性和低毒性的pH 響應(yīng)磁共振分子成像探針最有助于解決腫瘤生物學(xué)基本問題、評(píng)估腫瘤酸中毒與侵襲性之間的關(guān)系以及監(jiān)測(cè)新型抗癌療法的效果。

4 展望

腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的、多程序和多步驟的，而每一關(guān)鍵過程都與其酸性微環(huán)境相關(guān)。新型的磁共振成像技術(shù)及高pH 響應(yīng)磁共振分子成像探針研發(fā)將在在體可視化腫瘤生物學(xué)行為、反映腫瘤酸中毒與侵襲性等機(jī)制和表征方面發(fā)揮重要作用。與治療藥物的臨床轉(zhuǎn)化極富挑戰(zhàn)性不同，新型診斷技術(shù)方法與相關(guān)設(shè)備的設(shè)計(jì)研發(fā)無疑是目前最具臨床應(yīng)用潛力、可提供早期精準(zhǔn)以及個(gè)體化治療方案的臨床轉(zhuǎn)化研究熱點(diǎn)。在過去10 年中，雖然已經(jīng)解決了部分成像技術(shù)的局限性如空間和時(shí)間分辨率低、pH 敏感性不足和臨床應(yīng)用可行性等問題，然而磁共振pH 成像相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)方法和成像系統(tǒng)平臺(tái)還有待于突破，如：減少磁場(chǎng)狀態(tài)及條件對(duì)成像結(jié)果的干擾、優(yōu)化和提高信噪比，解決時(shí)間空間精準(zhǔn)匹配，縮短掃描時(shí)間、完善相關(guān)配套MR 硬件設(shè)施，開發(fā)具有強(qiáng)大圖像數(shù)據(jù)處理軟件甚至研發(fā)多核素同步成像的磁共振設(shè)備等，以促使腫瘤酸性微環(huán)境磁共振pH 成像技術(shù)成為一種實(shí)時(shí)在體、具有臨床應(yīng)用前景的新型無創(chuàng)診斷工具，與此同時(shí)加強(qiáng)研發(fā)pH 敏感成像相關(guān)分子成像探針及納米遞送系統(tǒng)等設(shè)計(jì)，促使腫瘤診療一體化的研究與發(fā)展。相信在不久的將來，磁共振pH 成像技術(shù)將為腫瘤患者提供最具診斷價(jià)值、指導(dǎo)相應(yīng)臨床治療方案制訂、監(jiān)測(cè)治療療效以及預(yù)后隨診的優(yōu)先級(jí)臨床實(shí)踐影像學(xué)檢查診斷技術(shù)方法。

圖2 A：30 mmol/L碘比醇溶液在不同pH下的CEST-MR圖像；B：異種移植瘤小鼠靜脈注射碘比醇(劑量為4 gI/kg b.w.)的CEST-MR圖像Fig.2 A: CEST-MR images of 30 mmol/L iobitridol solution titrated at different pH values; B: CEST-MR images of xenografted-tumor bearing mouse following iobitridol i.v.injection(dose 4 gI/kg b.w.).

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。