北美水貂源沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性檢測

劉勃興 趙安奇 王利麗 張雪佳 郭 蕊 丁家麟 史秋梅* 張志強*

(1.河北科技師范學院，河北省預防重點實驗室，秦皇島，066600；2.昌黎縣農業農村局，秦皇島，066600；3.秦皇島市海港區西港動物防疫監督站，秦皇島，066000)

沙門氏菌(Salmonella)病又稱副傷寒，是一種在毛皮動物養殖過程常見的急性傳染病，常發于6—8月，呈地方性流行，主要表現癥狀為發熱，下痢腹瀉，體重減輕，出現神經癥狀，流產等[1-3]。英國、丹麥、加拿大等國均有北美水貂(Mustelavison)感染沙門氏菌患病的報道，國內，在我國河北、東北三省、山東等地區也有相關病例報道[4-8]。目前，沙門氏菌的預防與治療以抗生素藥物為主。近年來對沙門氏菌的耐藥性研究結果顯示，人源、動物源沙門氏菌的多重耐藥情況和耐藥程度逐年遞增，并通過飲水和食物等方式在人和動物之間不斷傳遞[9-11]。抗生素類藥物濫用，給細菌造成選擇壓力是造成多重耐藥情況日益嚴重的主要原因之一，因此，在養殖中合理應用治療動物疾病尤為重要[12]。

本文對2019年秦皇島地區送檢北美水貂的沙門氏菌攜帶情況進行調查，并對分離菌株的致病性和耐藥性進行研究，旨在為該地區北美水貂沙門氏菌病的防治提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

2019年3—9月收集秦皇島地區病死北美水貂病料65份，30—180日齡不等。

1.2 主要試劑

H.E.瓊脂培養基購自青島海博生物公司；革蘭氏染色液購自京博奧拓達科技有限公司；ID32E腸桿菌科和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條購自法國梅里埃公司；D2000 plus DNA ladder，購自中科瑞泰科技有限公司；2×TaqMaster Mix，細菌DNA基因組提取試劑盒，膠回收試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；pMD19-T載體，購自寶日醫(TaKaRa)生物技術有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物科技股份有限公司；序列測定服務由上海生工生物工程公司提供。昆明小鼠(體重20±5 g)購自北京維通利華試驗動物有限公司。

1.3 引物

細菌16S rDNA鑒定通用引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TAC GGY TACCTTGTTACGACTT。

1.4 細菌的分離純化

無菌采取病死水貂肝臟、脾臟、心臟，于超凈臺中接種于H.E.瓊脂培養基，置于37℃恒溫培養箱中培養18—24 h，挑取黑綠色且中心有黑點的菌落重新于H.E.培養基中劃線純化培養18—24 h，挑取符合上述特征的單菌落接種于LB培養基中，置于37℃恒溫搖床培養18—24 h。

1.5 分離菌的革蘭氏染色

挑取純化后的單菌落進行革蘭氏染色，染色操作按照試劑說明書進行，染色后在光學顯微鏡下觀察細菌的染色特征和形態。

1.6 分離菌的生化鑒定

生化鑒定試驗參照ID32E腸桿菌科和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條進行，用ATB自動生化鑒定系統對結果判定。

1.7 分離菌的16S rDNA鑒定

按照細菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取分離菌的DNA作為PCR模板。PCR體系為：上、下游引物和模板各1 μL，ddH2O 22 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，總體積為50 μL。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環；72℃延伸10 min。用膠回收試劑盒回收1 500 bp左右條帶，回收產物連接pMD19-T載體并轉入DH5α感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養基培養，挑取陽性菌落置于含氨芐青霉素的LB培養基中增殖培養，送上海生工生物工程公司測序。測序結果在NCBI的BLAST分區檢索并比對分析。

1.8 分離菌的致病性試驗

參考文獻[13]中的劑量與方法，每株分離菌分別感染5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2 mL用高壓滅菌后的PBS調整濃度后的菌液(濃度1×108cfu/mL)，設置對照組一組，每只小鼠注射0.2 mL的無菌PBS，其余條件與分離菌感染組相同。觀察并記錄小鼠死亡發病情況。

1.9 分離菌的藥物敏感性試驗

按照美國臨床和試驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準的操作和判準，采用KB紙片法檢測分離菌對β-內酰胺類(氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林)，氨基糖苷類(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四環素類(多西環素、土霉素)，氟喹諾酮類(環丙沙星、恩諾沙星)，氯霉素類(氟苯尼考)，大環內酯類(替米考星)，磺胺類(磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、復方新諾明)，共計15種抗生素的敏感性。

2 結果

2.1 細菌的分離純化

從65份樣品中共計分離出9株疑似沙門氏菌的菌株。疑似菌株在H.E.瓊脂培養基培養菌落呈圓形，邊緣整齊，微凸，藍綠色，菌落中間有黑點(圖1A)。

2.2 分離菌的革蘭氏染色

經革蘭氏染色，9株分離菌均為革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓(圖1B)。

2.3 分離菌的生化鑒定

生化鑒定結果顯示，分離菌枸櫞酸鹽，d-葡萄糖，賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶試驗均為陽性。個別菌株可發酵麥芽糖、甘露醇。吲哚、尿素酶、丙二酸鹽等試驗均為陰性。ATB自動生化鑒定系統判定結果均為沙門氏菌，評定符合率均在99%以上。

2.4 分離菌的16S rDNA鑒定

將測序結果用NCBI的BLAST分區檢索，發現分離菌株與沙門氏菌屬的參考菌株同源性達97%—100%。結合上述鑒定結果，綜合判定9株分離菌為沙門氏菌，命名為SDS1-9。

2.5 分離菌的致病性試驗

分離菌感染小鼠后，小鼠出現明顯的神經癥狀，表現為站立不穩，瞇眼，抱爪蜷縮，個別小鼠出現糞便稀軟，呼吸急促癥狀。感染組小鼠出現死亡，死亡個數1—5個，死亡率20%—100%(圖2)。對照組小鼠無發病癥狀，無死亡。分離感染組小鼠肝臟、脾臟、心臟細菌，經鑒定分離出沙門氏菌。

2.6 分離菌的藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗結果顯示，分離菌株分別對5—11種抗生素耐藥，對2—5種抗生素表現中介，對2—8種抗生素敏感(圖3)。15種抗生素中無對頭孢曲松和阿米卡星表現耐藥的菌株，其余13種抗生素的耐藥率11.11%—100%，其中氟苯尼考、替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和復方新諾明的耐藥率高達100%。土霉素敏感率最高，為88.89%(8/9)(圖4)。對5種抗生素耐藥菌株1株，對6種抗生素耐藥菌株2株，對7種抗生素耐藥菌株1株，對8種抗生素耐藥菌株3株，對9種抗生素耐藥菌株1株，對11種抗生素耐藥菌株1株，分離菌株均具有多重耐藥性。

3 討論

Williams等[8]報道英國的12個養殖場316只病死貂中沙門氏菌患病率0.6%，Dietz等[7]報道由于飼料污染導致丹麥25個水貂養殖場水貂出現流產死胎，上述報道均表明在水貂養殖中沙門氏菌是重要的細菌性致病原。我國毛皮動物養殖起步較晚，但發展迅速，養殖數量和密度較大，存在養殖技術相對落后，管理粗放等問題，致使動物發病率較高，尤其是細菌性疾病，給養殖場造成嚴重的經濟損失[14-15]。本文對65份病死水貂病料中的沙門氏菌進行分離鑒定，分離率為13.85%，并通過小鼠致病性試驗發現分離菌株均具有一定的毒力。李鵬[16]用多重PCR方法檢測268份水貂胴體及內臟組織，沙門氏菌檢出率0.75%(2/268)；劉亭亭[4]從2009—2017收集的水貂病料中檢測出5株沙門氏菌。在李鵬[16]和劉亭亭[4]報道均有沙門氏菌檢出，但檢出率均比本文低，這可能與檢測方法和病料來源、時間等條件不同有關。

沙門氏菌有多種耐藥性產生機制，并可通過多種方法從環境中獲得耐藥性，給沙門氏菌病的防治造成困難[17]。本文對9株水貂源沙門氏菌的耐藥性進行研究，發現多重耐藥菌株高達100%，而試驗的15種抗生素中有5種抗生素耐藥性高達100%，表明分離菌株耐藥情況較為嚴重，且部分抗生素對分離菌株未表現出抗菌效果。據孫娜等[18]報道，其分離的7株水貂源沙門氏菌具有多重耐藥現象，對頭孢曲松、左氧氟沙星、氟苯尼考和多黏菌素較敏感，對氨基糖苷類藥物、四環素和氨芐西林表現為耐藥。據王海龍等[6]報道，其分離的水貂源沙門氏菌對環丙沙星、左旋氧氟沙星、克林霉素、頭孢曲松鈉高敏，對萬古霉素、硫酸黏菌素中敏，對丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素低敏。在本文與孫娜等[18]、王海龍等[6]的報道中，水貂源沙門氏菌均存在多重耐藥現象，且耐藥情況不同，這可能是由于時間、飼養與治療方式不同造成的。在臨床治療水貂沙門氏菌病時，建議可先通過藥物敏感性試驗篩選出最佳的抗菌藥物，制定合理的給藥方案，避免長期大劑量使用抗生素，減少養殖戶的經濟損失。

本文對秦皇島地區水貂源沙門氏菌進行分離鑒定，分離率13.85%(9/65)；對分離菌株的致病性及耐藥性進行研究，發現分離菌均具可致小鼠出現不同程度死亡，并分別對5—11種抗生素藥物耐藥，氟苯尼考、替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和復方新諾明的耐藥率高達100%，耐藥情況較為嚴重，為該地區水貂沙門氏菌病的預防和治療提供參考。