熒光PCR探針熔解曲線法檢測結核分枝桿菌對利福平、異煙肼、喹諾酮及卡那霉素耐藥性的評價*

劉春平, 譚耀駒, 蘇碧儀, 馬品云

廣州市胸科醫院醫學檢驗科(廣東廣州 510095)

結核病是全球范圍內一種重要的傳染病，嚴重危害人類的生命健康。耐多藥結核是指同時對利福平和異煙肼產生耐藥，廣泛耐藥結核在耐多藥結核基礎上，對二線藥物喹諾酮類以及3種二線注射藥物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少一種產生耐藥。據世界衛生組織估計，2017年全球約有55.8萬例耐多藥結核患者，1.08萬例廣泛耐藥結核患者[1]。耐多藥結核和廣泛耐藥結核逐年增加，給結核病的預防和控制帶來了嚴峻的挑戰。耐藥結核病治療時間長，治愈率低，傳播風險高，早期快速的診斷是合理治療的基礎，也是耐藥結核病防治的關鍵所在。目前確診耐多藥結核需要分離結核分枝桿菌進行培養、菌種鑒定及藥敏試驗，傳統的表型藥敏試驗耗時長、操作復雜，延誤患者的診斷和治療時間，因此，建立快速準確檢測結核桿菌耐藥性的方法才能滿足臨床耐多藥結核診斷的需求。隨著分子生物學技術的飛速發展，耐藥結核病的相關基因快速診斷技術也隨之被使用。2011年WHO推薦Xpert MTB/RIF技術用于結核的快速診斷和利福平耐藥性檢測[2]，但成本高且只能檢測利福平單一耐藥性。本研究采用熒光PCR熔解曲線方法檢測治療結核分枝桿菌一線藥物利福平和異煙肼以及二線藥物喹諾酮和卡那霉素的耐藥突變，并與表型藥敏試驗方法比較，以評價該方法在早期快速診斷耐多藥結核和廣泛耐藥結核中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年12月至2014年3月廣州市胸科醫院216例涂陽肺結核患者的痰標本。男161例，女55例，年齡(50.56±17.43)歲。

1.2 方法

1.2.1 標本收集和培養 經金胺O染色證實為陽性的痰標本，加入2～3倍體積的4% N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)，液化15min。將液化后的痰標本分成兩份，一份用于DNA提取，一份用于分離培養。分離培養按照中國防癆協會《結核病診斷實驗室檢驗規程》使用BACTEC MGIT960全自動分枝桿菌培養儀進行[3]。

1.2.2 結核分枝桿菌菌種鑒定和藥敏試驗 對分離培養出的陽性產物按照中國防癆協會《結核病診斷實驗室檢驗規程》實驗操作方法進行結核分枝桿菌菌種鑒定和利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素藥敏試驗[3]。

1.2.3 結核分枝桿菌DNA的提取 取1 mL液化后的痰標本，12 000×g離心10 min，棄上清液。重懸于250 μL TB DNA提取液中，渦旋振蕩混勻。封口膜封口，99℃加熱10 min，12 000×g離心10 min，轉移上清液至半自動核酸提取儀(廈門致善生物科技股份有限公司)進行核酸提取，提取液作為DNA模板。

1.2.4 熒光PCR熔解曲線法檢測利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素耐藥性 采用熒光PCR熔解曲線法(結核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒、異煙肼耐藥突變檢測試劑盒、喹諾酮耐藥檢測試劑盒和卡那霉素耐藥檢測試劑盒，均為廈門致善生物科技股份有限公司)檢測利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素的耐藥性。利福平耐藥突變檢測結核分枝桿菌復合群rpoB 507-534核心區位點的突變。異煙肼耐藥突變檢測ahpC啟動子區(-44～-30、-15～3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(-17～-8位點)以及katG315密碼子的突變。喹諾酮耐藥突變檢測gyrA基因88～94位密碼子的突變。卡那霉素耐藥突變檢測rrs基因的4個位點(1401、1402、1473和1484位點)和eis基因啟動子區(-10、-14和-37位點)的3個突變位點。所有的PCR反應體系均為25 μL。實驗操作步驟嚴格按照說明書進行，并參照試劑盒說明書進行結果判讀。利福平、異煙肼和卡那霉素的每個標本有兩個反應管，每種突變檢測FAM和TET兩個通道熒光信號，即每個標本有4個通道的檢測結果。而喹諾酮每個標本有一個反應管，只檢測FAM一個通道熒光信號，每個標本有2個檢測結果。操作流程簡述如下：配制PCR反應液：取n×19.6 μL PCR Mix A和n×0.4 μL TB酶混合液加入至1.5 mL 離心管內，混勻，向每支PCR反應管內分裝20 μL，再加入5 μL相應提取樣品或陽/陰性對照，PCR擴增儀上進行PCR擴增和熔解分析。

1.3 統計學方法 用SPSS 21.0統計軟件，以表型藥敏試驗為標準，計算熒光PCR探針熔解曲線法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率和Kappa值。

2 結果

2.1 液體培養和菌種鑒定結果 金胺O染色結果為陽性患者的痰標本共216份進行分離培養，7份(3.24%)污染，培養陰性的標本有12份(5.56%)，獲得陽性培養菌株有197份(91.20%)。后經菌種鑒定15份(7.61%)為非結核分枝桿菌，最終獲得182份(92.39%)結核分枝桿菌臨床分離株。見表1。

表1 216份痰標本液體培養、菌鑒及熔解曲線法檢測結果 份

2.2 藥敏試驗結果 182份臨床結核桿菌分離株中，其中34份(18.68%)為利福平耐藥株，敏感株為148株(81.32%)；53份(29.12%)為異煙肼耐藥株，129份(70.88%)為敏感株；22份(12.09%)為喹諾酮耐藥株，160份(87.91%)為敏感株；5份(2.75%)為卡那霉素耐藥株，177份(97.25%)為敏感株。其中同時對利福平和異煙肼耐藥者有33株(18.13%)，同時對利福平、異煙肼和喹諾酮耐藥者有17株(9.34%)，同時對利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素4種均耐藥者有1株(0.55%)。

2.3 熒光PCR熔解曲線法結果 熒光PCR探針熔解曲線法檢測216份痰標本結核桿菌耐藥性，15份(6.94%)檢測無效，其中1份對利福平無效、1份對異煙肼無效、3份對卡那霉素無效；2份同時對利福平和異煙肼無效；2份對利福平、異煙肼和卡那霉素3種均無效；6份對利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素同時無效。檢測有效的201份(93.06%)痰標本中，40份(19.90%)對利福平耐藥，161份(80.10%)對利福平敏感；46份(22.89%)對異煙肼耐藥，155份(77.11%)對異煙肼敏感；23份(11.44%)對喹諾酮耐藥，178份(88.56%)對喹諾酮敏感；3份(1.49%)對卡那霉素耐藥，198份(98.51%)對卡那霉素敏感。其中檢測出36份(17.91%)同時對利福平和異煙肼耐藥，15份(7.46%)同時對利福平、異煙肼和喹諾酮耐藥，2份(0.99%)同時對4種抗結核藥物耐藥。

2.4 熒光PCR熔解曲線法敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率及Kappa值 174份標本同時獲得藥敏試驗及熒光PCR探針熔解曲線法檢測利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素的耐藥性結果，以表型藥敏試驗結果為標準，熒光PCR熔解曲線法分別檢測利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素耐藥的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及符合率結果見表2。熒光PCR探針熔解曲線法與表型藥物敏感度試驗檢測結核分枝桿菌對利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素耐藥性的Kappa值分別為0.89、0.81、0.91和0.66。

表2 結核分枝桿菌對利福平、異煙肼、喹諾酮及卡那霉素藥物的耐藥效能

3 討論

結核分枝桿菌具有特有的、高疏水性的細胞壁保護、外排泵以及產生β-內酰胺酶的降解酶等功能，降低某些藥物的滲透而表現天然抗性[4]。它不同于其他的細菌借助質粒、轉座子和整合子產生耐藥，其耐藥性的產生主要是由于染色體上編碼藥物靶點的基因或藥物活性有關的酶基因特定區域的堿基突變所致。隨著對耐多藥結核病耐藥機制的認識，各種檢測結核分枝桿菌耐藥基因突變的試驗方法正在得到積極研制和應用。熒光PCR探針熔解曲線法是PCR和熔解曲線分析方法的結合，由于野生型序列具有自身特定的熔點，當基因突變時探針結合力下降導致熔點下降，通過監測熒光雜交信號區分出野生型與突變型。

約95%的利福平耐藥菌株是由rpoB基因上81 bp的耐藥決定區突變所致，突變后利福平不能與細菌RNA聚合酶的β-亞基結合，出現耐藥[5]。幾乎所有的利福平耐藥株同時也對異煙肼耐藥，因此rpoB基因的突變是耐多藥結核菌株的標志，單獨對利福平敏感度分析可作為耐多藥的篩選指標[6]。本研究藥敏試驗僅發現1株利福平耐藥，而異煙肼敏感現象。以表型藥敏試驗為標準，熒光PCR熔解曲線檢測結核分枝桿菌對利福平耐藥的敏感度、特異度和符合率與以往文獻報道[7-10]相一致。與WHO推薦的Xpert MTB/RIF技術檢測利福平耐藥性的敏感度和特異度[11]相比較，該方法具有同等的檢驗效能。

異煙肼結構雖然簡單，但耐藥卻是一個非常復雜的過程，約80%以上的異煙肼耐藥結核桿菌發生在katG 315密碼子、inhA啟動子的-15和-8位或ahpC啟動子區域的-6～-47位點的堿基突變[12]。以表型藥敏試驗為參照，熒光PCR熔解曲線檢測結核分枝桿菌對異煙肼耐藥的敏感度為76.00%。雖然本研究使用的試劑盒涵蓋80%以上的常見結核分枝桿菌異煙肼突變位點，但仍有20%突變位點不能檢測，或存在其他耐藥機制以及所用的臨床菌株存在差異等，這些可能是造成敏感度略低于文獻報道[13]的主要原因。熒光PCR探針熔解曲線法檢測異煙肼耐藥的Kappa值為0.81，表明該方法與表型藥敏試驗具有高度的一致性。此外本研究發現熒光PCR探針熔解曲線法檢測利福平或異煙肼為耐藥突變，而藥敏試驗結果卻為敏感，可能與熒光PCR探針熔解曲線法過于敏感、低水平耐藥基因突變后仍對藥物敏感或藥敏操作中出現失誤相關，但最終還需基因測序進一步驗證。

目前針對一線抗結核藥物利福平和異煙肼的耐藥基因的研究較多，而針對二線抗結核藥物喹諾酮和卡那霉素耐藥分子診斷相對較少。左氧氟沙星和莫西沙星已被WHO推薦為治療耐多藥結核病的核心藥物。因此針對喹諾酮耐藥的檢測亦很重要。喹諾酮耐藥結核桿菌多發生在DNA旋轉酶的gyrA基因保守區67～106位的密碼子區發生突變，常見的突變有94位GAC→GCC/CAC/TAC及90位GCC→GTG[14]。本研究采用的熒光PCR探針熔解曲線法試劑盒涵蓋約70%～90%的喹諾酮突變位點，以藥敏試驗為參照，其敏感度為85.00%，特異度為100.00%，與文獻[15]報道基本一致。與藥敏試驗方法具有高度一致性，因此該方法在快速檢測喹諾酮耐藥性上具有重要的應用價值。

本研究以藥敏試驗為參考，熒光PCR探針熔解曲線法檢測卡那霉素的特異度和符合率均很高，但敏感度和一致性均明顯低于使用同樣試劑盒的文獻報道[16]。分析敏感度和一致性低的原因可能是本研究中182份結核分枝桿菌臨床分離株中卡那霉素耐藥率僅有2.75%，陽性樣本數太少以及熒光PCR探針熔解曲線法檢測卡那霉素無效率占66.67%，使檢驗效率存在嚴重偏倚，在今后的研究中還需擴大陽性樣品數和優化該檢測方法進一步評估其檢驗效能。

另外本研究發現液體培養污染和培陰的19例標本中，16份熒光PCR熔解曲線法檢測有效。菌種鑒定為非結核分枝桿菌的15份標本中，11份熒光PCR熔解曲線法判定為有效檢測，而182份檢測出表型藥敏試驗結果的標本中有8份熒光PCR熔解曲線法卻存在無效檢測現象。由此可見，雖然在一定程度上熒光PCR熔解曲線法可彌補培養過程中的污染和培陰造成耐藥性的漏檢，但同時自身也存在一定的漏檢和誤判情況。

綜上所述，雖然熒光PCR熔解曲線技術存在一定的局限性，但總體來講此方法在檢測結核分枝桿菌利福平、異煙肼和喹諾酮耐藥性方面具有較高的敏感度和特異度，與藥敏試驗具有高度的一致性，并且簡單快速，僅需要2～3 h即可檢出多種抗結核藥物的耐藥性，擴增和結果判讀在一個反應管內進行，成本低，生物安全性較好。因此，該方法在快速診斷耐藥結核病上具有良好的應用前景，可以及時治療和管理結核病患者，對控制耐多藥結核和廣泛耐藥結核具有重要意義。