肺結核患者支氣管肺泡灌洗液miRNA-431、Notch2表達與結核桿菌耐藥性的關系*

王光輝, 張紅霞, 許俊麗, 祁元明

1漯河市第七人民醫院(漯河市傳染病醫院)呼吸科(河南漯河 462000)； 2鄭州大學生命科學學院(河南鄭州 450002)

結核病由結核分枝桿菌感染引起，以肺結核最為常見，臨床表現為咳嗽、咳痰、咯血、消瘦等癥狀。結核病可能隨著病情惡化導致多器官發生病變，是全球十大死亡原因之一，病死率居單一傳染病首位，是嚴重的全球性公共衛生問題之一，多藥耐藥及廣泛耐藥結核菌的出現增大了肺結核的治療難度，使結核病的病死率進一步增加[1-2]。目前，肺結核耐藥性的形成機制尚不明確，可能與機體免疫反應有關[3]。微小RNA(microRNA，miRNAs)在機體廣泛分布，是一種內源性單鏈非編碼RNA，能夠調控轉錄后靶基因表達，參與細胞增殖、分化及凋亡過程，多種miRNAs在耐藥結核菌患者中表達異常[4-6]，miR-431與機體免疫反應有關[7]，鮮見報道其與耐藥結核菌的關系。Notch信號通路具高度保守性，參與血管形成、胚胎發育、腫瘤發生等生理、病理過程，已有研究發現Notch信號通路能夠促進肺干細胞增殖及肺組織修復，與結核病密切相關[8-9]，Notch2是Notch信號通路的重要受體蛋白，在肺癌、肝癌、膠質瘤等多種腫瘤中表達異常，且與預后及化療抵抗相關[10-11]。本研究旨在探討miR-431、Notch2在耐藥肺結核患者支氣管肺泡灌洗液中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2019年4月在本院住院的320例活動性肺結核患者進行研究，均符合《肺結核診斷與治療指南》中活動性肺結核診斷標準[12]，依據WHO《耐藥結核病規劃管理指南》[13]將活動性肺結核患者分為耐藥組(153例)、非耐藥組(167例)。耐藥組中男92例，女61例，年齡20～72歲，平均(46.26±13.35)歲，其中耐多藥肺結核患者112例(耐多藥組)，男65例，女47例，年齡(46.72±11.54)歲，耐多藥組應符合：對異煙肼、利福平均表現出耐藥性。廣泛耐藥肺結核患者41例(廣泛耐藥組)，男27例，女14例，年齡(46.03±11.76)歲，廣泛耐藥組應符合：對異煙肼、利福平、氟喹諾酮三類及卷曲霉素、阿米卡星、卡那霉素3種中任一種表現出耐藥性。非耐藥組中男97例，女70例，年齡23～72歲，平均(47.81±12.06)歲。排除標準：(1)初治肺結核患者；(2)合并心、肝、腎臟器嚴重疾病者；(3)合并自身免疫性疾病者；(4)合并惡性腫瘤者；(5)合并妊娠、哺乳女性；(6)合并風濕性疾病者；(7)臨床資料不完整。另外選取120例在本院自覺“胸痛”經肺部檢查無異常者為對照組，其中男53例，女67例，年齡26～71歲，平均(46.85±11.51)歲。納入標準：(1)X線檢查結果顯示肺部未見異常；(2)結核菌素純蛋白衍生物(purified proteiderivative，PPD)檢查呈陰性。排除標準：(1)肺結核病史者；(2)～(7)同肺結核患者排除標準(2)～(7)。耐藥組、非耐藥組、對照組3組性別、年齡相比，差異無統計學意義(P>0.05)；耐多藥組、廣泛耐藥組兩組性別、年齡相比，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 支氣管肺泡灌洗液標本采集 肺結核患者行纖維支氣管鏡檢查，依據X線胸片、CT確定灌洗部位，影像學檢查未見病變者，選擇右肺中葉或左肺舌段進行灌洗，灌洗前告知受檢者注意事項并給予耐心指導。用2%利多卡因20 mL對將灌洗肺段進行局部麻醉，將150 mL適宜溫度的無菌生理鹽水通過纖維支氣管鏡灌洗導管灌入支氣管肺部，灌洗操作分3次輕柔進行，灌洗后以100 mmHg負壓回收灌洗液，回收率應>40%，收集支氣管肺泡灌洗液5 mL?；厥盏墓嘞匆河秒p層紗布過濾以除去黏液，3 000 r/min離心15 min，保留上清液，-80℃保存待檢。

1.2.2 miR-431、Notch2表達檢測 采用熒光實時定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)檢測支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達。采用Trizol法總RNA，反轉錄為cDNA，進行PCR擴增反應。miR-431正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，Notch2 mRNA正向引物：5′-GGGACCCTGTCATACCCTCT-3′，反向引物：5′-GAGCCATGCTTACGCTTTCG-3′，內參基因U6正向引物：5′-AGGTGTCTTGCAGGCCGT-3′，反向引物：5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，反應條件：95℃預變性10 min，95℃ 10 s，60℃ 60 s，40個循環，引物及試劑盒均購于上海酶聯生物科技有限公司，操作嚴格按照說明書進行，采用2-ΔΔCt法計算miR-431、Notch2表達，依據中位數分為miR-431低表達、miR-431高表達；Notch2低表達、Notch2高表達。

2 結果

2.1 對照組、非耐藥組、耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達比較 與對照組相比，非耐藥組、耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達均較高(P<0.05)，Notch2表達均較低(P<0.05)；與非耐藥組相比，耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達均較高(P<0.05)，Notch2表達均較低(P<0.05)。見表1。

表1 各組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達比較

2.2 耐多藥組、廣泛耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達比較 與耐多藥組相比，廣泛耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達較高(P<0.05)，Notch2表達較低(P<0.05)。見表2。

表2 耐多藥組、廣泛耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達比較

2.3 耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達與臨床病理特征關系 miR-431、Notch2表達與性別、結核空洞均無關(P>0.05)，與年齡、吸煙史、耐藥情況、病灶所占肺野均有關(P<0.05)。見表3。

表3 耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達與臨床病理特征關系

2.4 耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達相關性分析 Spearman分析結果顯示，耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達呈負相關(r=-0.556，P=0.000)。見圖1。

圖1 耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達相關性分析的散點圖

2.5 影響結核病患者是否耐藥的多因素logistic回歸分析 以結核病患者是否耐藥為因變量(非耐藥賦值為0，耐藥賦值為1)，以性別、年齡、吸煙史、結核空洞、病灶所占肺野、miR-431、Notch2為自變量進行多因素logistic回歸分析，將女性、年齡<60歲、無吸煙史、無結核空洞、病灶所占肺野≤3個、miR-431低表達、Notch2低表達均賦值為0，相應地將男性、年齡≥60歲、有吸煙史、有結核空洞、病灶所占肺野>3個、miR-431高表達、Notch2高表達均賦值為1，結果表明，病灶所占肺野>3個、miR-431高表達均是結核病患者發生耐藥性的獨立危險因素(P<0.05)，Notch2高表達是獨立保護因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響結核病患者是否耐藥的多因素logistic回歸分析結果

3 討論

結核分枝桿菌是結核病的致病菌，在全球范圍內，結核分枝桿菌的感染率可達1/3，結核病是嚴重威脅人類健康的慢性傳染性疾病，中國是結核病高負擔國家之一，關于結核病的防治一直受到高度重視。結核菌感染者不一定發展為結核病，對所有感染者進行預防性治療是不必要且不實際的，應選擇結核病的高危人群進行重點防治。耐藥結核治療周期長，治愈率低，更易傳播，中國有超過1/2的耐藥結核患者為初治患者，進一步增大了結核病的預防性治療難度，探究耐藥肺結核的形成對于結核病的防治形勢具有戰略性意義[14-15]。

miR-431與肺部發育及肺癌等均有關[16-17]。沈艷青等[17]通過芯片篩選技術發現miR-431在大鼠胎肺發育過程中呈連續低表達，并用連續形態學觀察對miR-431表達情況進行進一步驗證，發現miR-431在孕19 d表達最高，之后隨著肺部發育呈逐漸下降趨勢，在出生后3 d miR-431降低至幾乎不表達；形態學變化顯示孕19 d時胎肺出現板層小體及Ⅱ型肺泡上皮細胞，且隨著胎齡增加而增加，出生后肺泡迅速形成，微血管系統逐漸發育成熟，以上提示miR-431在肺發育過程中可能起著負向調控作用，可能參與肺部相關疾病病程。研究發現，肺癌細胞系及組織中miR-431均為低表達，上調miR-431可抑制肺癌細胞增殖、侵襲、遷移，有望成為治療肺癌的新生物靶點[18]。Notch信號通路與肺癌耐藥性的作用機制十分復雜，抑制Notch信號通路能夠促進腫瘤細胞凋亡，發揮逆轉腫瘤耐藥的作用，但另一方面，Notch信號通路也參與腫瘤耐藥性的維持[10-11]。研究發現，miR-431在黑色素瘤細胞、組織中均為低表達，且與病情演變密切相關，可用于預后預測，作用機制是miR-431可通過直接靶向作用于Notch2發揮抑制黑色素瘤細胞生長、遷移、侵襲的作用[19]。本研究發現，對照組、非耐藥組、耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達依次升高，Notch2表達依次降低；與耐多藥組相比，廣泛耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達較高，Notch2表達較低，提示miR-431、Notch2可能參與結核病耐藥性的形成及發展；進一步分析顯示，耐藥組miR-431、Notch2表達與性別、結核空洞均無關，與年齡、吸煙史、耐藥情況、病灶所占肺野均有關，且miR-431、Notch2表達呈負相關，提示miR-431、Notch2與耐藥結核患者的臨床病理特征關系密切，可能成為評估病情的生物標志物，miR-431可能通過調控Notch2表達參與結核耐藥性的發生；多因素logistic回歸分析結果顯示，病灶所占肺野>3個、miR-431高表達均是結核病患者發生耐藥性的獨立危險因素，Notch2高表達是獨立保護因素。miR-431與結核耐藥性的發生機制已有研究報道，多耐藥基因1(multidrug resistance gene 1，MDR1)在耐藥機制中發揮重要作用[20]。Wu等[7]研究發現，結核分枝桿菌感染后，miR-431表達上調，對MDR1的轉錄調節因子-熱休克因子1產生抑制作用，使巨噬細胞中MDR1表達增加，抵抗結核藥物，從而提高細胞內結核分枝桿菌存活率，可能是結核耐藥性的發生機制之一。

綜上所述，miR-431、Notch2在耐藥結核患者支氣管肺泡灌洗液中異常表達，且與臨床病理特征存在相關性，可能成為耐藥結核患者的病情評估標志物，也為結核患者耐藥性的形成機制提供參考。