雙硫侖聯合銅通過調控視神經萎縮蛋白1誘導舌癌細胞凋亡

金 杯，戴盼盼，孫 旺，顧衛燕，林海升，施更生

舌癌是常見的口腔惡性腫瘤，在所有口腔癌患者中的構成比為 32.5%～50.6%，并且手術治療難度大，對放化療特異性不佳，綜合療效不理想[1]。因此，尋找新的治療方法具有重要意義。雙硫侖(disulfiram，DSF)多年來被用于治療慢性酒精中毒，近年來研究發現其與臨床相關濃度的銅結合對多種惡性腫瘤顯示出抗癌作用，但是與舌癌相關的研究甚少，具體機制尚不明確。視神經萎縮蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)調控線粒體的網絡融合，與線粒體功能密切相關，并在細胞凋亡中發揮了重要的作用[2]。此外，研究發現OPA1與腫瘤的惡性變有關[3]。因此，本研究探討DSF-Cu對舌癌細胞Cal-27凋亡的影響以及OPA1在其中的作用，為DSF-Cu在臨床上的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

舌鱗狀細胞癌細胞Cal-27(上海中喬新舟生物科技有限公司，批號ZQ0606)；MEM細胞完全培養基(上海中喬新舟生物科技有限公司，批號ZQ-301)；胰蛋白酶(美國Gibco公司，批號25200-056)；DSF(美國Sigma公司，批號86720)；氯化銅(美國Sigma公司，批號C3279)；(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(美國Sigma公司，批號M2128)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司，批號D5879)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國Sigma公司，批號APOBRDU)；β-actin一抗(美國Sigma公司，批號A1978)；ATP檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，S0026)；OPA1(BD Biosciences，批號612606)。CO2恒溫培養箱(Thermo，美國)；酶標儀(Bio-TEK，美國)；流式細胞儀(Becton，美國)；電泳儀(BIO-RAD，美國)；曝光儀(BIO-RAD，美國)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑配制 DSF經DMSO溶解并稀釋成2 mmol/L，分裝后-20 ℃保存；氯化銅用無菌PBS溶解配制成50 mmol/L后經孔徑0.22 μm無菌過濾器過濾后4 ℃保存，臨用前用培養基將上述溶液稀釋成所需工作液濃度。

1.2.2 細胞培養及分組 將含100 U/mL青霉素G和100 μg/mL鏈霉素的MEM完全培養基培養細胞，置于37 ℃、5%CO2培養箱，待細胞長至70%～80%融合時，用胰蛋白酶消化傳代。細胞處理：對照組:MEM完全培養基培養；DSF-Cu低濃度組：50 nmol/L的DSF-Cu培養24 h；DSF-Cu中濃度組：100 nmol/L的DSF-Cu培養24 h；DSF-Cu高濃度組：400 nmol/L的DSF-Cu培養24 h。

1.2.3 細胞增殖活性率檢測 采用MTT法進行檢測。將細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔板，培養24 h后按不同分組處理后棄上清，換成無血清培養基，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，37 ℃、5%CO2培養箱避光培養4 h。小心吸棄孔內上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上避光低速震蕩10 min使結晶完全溶解，酶標儀490 nm檢測吸光度值，實驗重復3次。細胞增殖活性率=(各實驗組吸光度值-調零孔吸光度值)/(對照組吸光度值-調零孔吸光度值)×100%。

1.2.4 細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙標記結合流式細胞儀進行檢測。根據Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 ATP含量檢測 根據ATP試劑盒說明書進行操作，采用熒光素酶發光法以酶標儀檢測細胞中ATP的含量。

1.2.6 蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測。將蛋白提取定量后加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min使蛋白充分變性。配制5%濃縮膠以及12%分離膠，每孔上樣20 μg蛋白，SDS-PAGE電泳分離后濕轉法將蛋白電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，將膜分別轉入含一抗的稀釋液中(OPA1 1∶2 000，β-actin 1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，化學發光成像儀曝光，掃描圖像并用image J軟件分析灰度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對結果進行單因素方差分析以及 LSD-t檢驗，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 SF-Cu對Cal-27細胞增殖活性的影響

如圖1所示，與對照組相比，50、100、200、400、600、800、1 000 nmol/L的DSF-Cu處理Cal-27細胞24 h后增殖活性均下降(P<0.05)，并且濃度越高，抑制作用越大，呈濃度依賴性。

*表示實驗組與對照組比較，P<0.05

根據MTT結果，100 nmol/L濃度的DSF-Cu處理后達到半數抑制率，而200 nmol/L的濃度與之比較結果相近，此外，考慮600、800、1 000 nmol/L的DSF-Cu處理后細胞多數死亡，分析意義不大，因此，本實驗后續研究采用50 nmol/L低濃度、100 nmol/L中濃度以及400 nmol/L高濃度的DSF-Cu進行后續實驗。

2.2 DSF-Cu對Cal-27細胞形態的影響

如圖2倒置顯微鏡下( ×100)所示，與對照組相比，不同濃度DSF-Cu處理后細胞數目減少，細胞皺縮，貼壁不牢，并且濃度越高，抑制作用越明顯。細胞狀態與MTT結果相符。

2.3 DSF-Cu對Cal-27細胞凋亡的影響

應用流式細胞術比較DSF-Cu對Cal-27細胞凋亡的作用，如圖3所示，50 nmol/L的DSF-Cu處理后與對照組無明顯差異，而100、400 nmol/L的DSF-Cu處理后細胞早凋及晚凋率均顯著增加，與濃度變化呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)，說明DSF-Cu能夠誘導舌癌細胞凋亡。

2.4 DSF-Cu對Cal-27細胞ATP含量的影響

與對照組相比，50 nmol/L的DSF-Cu處理后細胞ATP含量稍下降(P<0.05)，而100、400 nmol/L的DSF-Cu顯著降低了細胞的ATP含量，其中400 nmol/L的濃度抑制作用最強，說明DSF-Cu對ATP生成的抑制作用與濃度相關(圖4)。

圖2 不同濃度DSF-Cu對Cal-27細胞形態的影響( ×100)Fig.2 The effect of DSF-Cu on the morphology of Cal-27 cells( ×100)

A： 0 nmol/L的DSF-Cu; B： 50 nmol/L的DSF-Cu; C： 100 nmol/L的DSF-Cu; D： 400 nmol/L的DSF-Cu

*：與對照組比較，P<0.05

2.5 DSF-Cu對OPA1蛋白表達的影響

DSF-Cu對舌癌細胞OPA1蛋白表達水平影響結果如圖5所示，低濃度50 nmol/L的DSF-Cu對OPA1蛋白表達水平無明顯影響，而高濃度100、400 nmol/L的DSF-Cu處理后OPA1蛋白表達水平較對照組顯著下降(P<0.05)，但兩者之間比較差異無統計學意義。

3 討 論

口腔癌是世界排名第十六的常見腫瘤，據估計，僅2018年就新診斷出35.5萬病例，超過17.7萬人死亡[4]。舌癌發病率居口腔癌首位，近年來在年輕人中發病率逐漸增加，尤其是在年輕女性中[5]。由于舌癌發病位置特殊，術后對頜面形態、功能及生活質量均有影響，且手術難度高， 放化療療效不佳，五年生存率僅為50%～60%[1]，因此尋找療效高、副作用小的替代藥品尤為迫切。考慮到諸如成本低、風險低和耗時少等優點，將已獲批準的藥物重新用作新的抗癌藥物是一種有前景的策略。

*：與對照組比較，P<0.05

DSF用于抗酗酒治療已經有60多年的歷史。在過去的十年中，越來越多的證據表明DSF在治療人類癌癥方面具有巨大的潛力。DSF的抗癌活性已在體外和體內模型中得到驗證[6-7]。目前已證實DSF可以使腫瘤細胞對放療敏感，并增強抗癌藥的細胞毒性，可以作為輔助治療。DSF能通過靶向作用于醛脫氫酶(一種癌癥干細胞的標志物)抑制癌癥干細胞，此外，DSF還能誘導癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖及轉移[8-9]。研究表明，DSF是強金屬螯合劑，與Cu離子結合形成二乙基二硫代氨基甲酸銅[Cu(DDC)2]絡合物，具有優異的抗癌功效[10]，但其在舌癌的研究甚少，并且相關機制尚不明確。本研究結果顯示，DSF-Cu有抑制舌癌細胞增殖、誘導其凋亡的作用，并且呈濃度依賴性，符合既往研究結果。

線粒體是細胞的動力工廠，其損傷會導致細胞能量生成障礙，進而細胞功能失調，最終發生病理性凋亡[11]。研究發現，線粒體靶向藥物通過線粒體功能障礙觸發癌細胞的凋亡較其他藥物更有效[12]，改變線粒體代謝可能是治療癌癥的潛在方向。已有研究證實，DSF-Cu能夠導致線粒體活性氧增加，膜電位降低，引起線粒體功能紊亂，誘導乳腺癌細胞[13]、腦癌細胞[14]凋亡。本研究檢測DSF-Cu處理后的細胞ATP含量發現，DSF-Cu顯著降低癌細胞ATP含量，并且與處理濃度呈正相關，說明DSF-Cu誘導舌癌細胞凋亡可能與線粒體功能障礙有關。

線粒體穩態的維持、有效的呼吸作用和線粒體DNA的遺傳取決于線粒體膜的正確結構以及內膜的動態重塑。OPA1位于線粒體內膜中，是調節線粒體融合的主要蛋白，參與線粒體的分裂、融合，維持線粒體的動態平衡及功能[2]。線粒體分裂、融合的不平衡會導致線粒體動力學改變，進而出現線粒體功能紊亂，導致細胞凋亡[15]。最新研究表明，OPA1與腫瘤的惡性生物學行為有關[16-18]。應用抗腫瘤藥物可以有效抑制OPA1表達，破壞線粒體動力學平衡，已被證實能導致乳腺癌細胞[19]、骨肉瘤細胞[20]凋亡。本實驗采用Western blot檢測舌癌細胞中OPA1蛋白的變化，結果顯示中、高濃度的DSF-Cu能夠下調OPA1蛋白表達水平，這提示OPA1參與了DSF-Cu誘導的舌癌細胞凋亡。

綜上所述，DSF-Cu可以抑制舌癌細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能是通過抑制OPA1蛋白的表達，進而導致線粒體功能紊亂，ATP合成減少來作用。本研究結果有望為DSF-Cu在抗癌治療方面的應用提供理論基礎。