基于網絡藥理學的甘草治療潰瘍性結腸炎作用機制研究△

李晴霞，康念欣，袁炎炎，劉永剛，譚鵬

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

潰瘍性結腸炎(UC)是一種消化系統常見的難治性、非特異性慢性炎癥性腸道炎癥疾病，病變主要位于結腸的黏膜層，以潰瘍為主，大多會涉及直腸和遠端結腸，也可能會向近端擴展，導致潰瘍遍布整個結腸。UC以腹瀉、腹痛、血便為主要臨床癥狀，其病因較為復雜，尚未完全闡明。目前，UC的發病機制被認為與飲食、腸道微生物結構、遺傳等多種因素有關，但中醫認為其多由脾胃功能失調、濕熱內蘊，與氣血搏結、化為膿血所致，與中醫學中的“痢疾”“腸癖”相近[1]。UC主要發生在30～40歲，其治療難度較大、易反復發作，病程可長達幾十年甚至伴隨終生[2]。UC患者由于慢性炎癥反復發作，結腸癌的患病概率也逐漸升高，病程30年的UC患者結腸癌變的幾率達到30%[3-4]。越來越多的研究表明，UC的常規化學藥物治療效果不夠理想，而中藥的優勢在于能夠控制其發作次數和間隔時間，緩解患者的臨床癥狀[5]。

甘草是豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的根及根莖，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳等功效[6]。研究表明，甘草除具有鎮痛、鎮咳、抗炎、抗變態反應、增強機體免疫功能等作用外，還具有抗潰瘍的作用[7]。有學者統計了治療UC的中藥，頻次最高的前3味中就有甘草[8]。Takhshid等[9]研究表明，甘草提取物可降低結腸炎性反應和水腫。Liu等[10]研究表明，甘草對UC具有抗炎的作用。目前，主要是從單一成分或單一靶點對甘草治療UC的作用機制進行研究。中藥是通過多成分作用于多靶點，調控多條通路來達到治療疾病的目的，從單一方面研究很難闡明其作用的整體性與系統性。網絡藥理學是一種研究傳統藥物的新模式，以計算機技術為基礎，將系統生物學和多向藥理學的方法加以整合，探討中藥活性成分、靶點、生物學通路及疾病之間的關系，從而在整體水平上闡明中藥藥效的作用機制。因此，本研究借助網絡藥理學方法，通過建立“成分-靶點-信號通路”網絡，從整體角度探討甘草治療UC的作用機制，為甘草治療UC的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 甘草入血活性成分篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)，以“甘草”為關鍵詞檢索，得到甘草中的化學成分，再以口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18為條件篩選活性成分。

1.2 成分-靶點網絡構建

通過TCMSP查詢篩選出的化合物作用靶點。所得的靶點輸入UniProt數據庫，使用UniProtKB查詢靶蛋白對應靶基因的規范名稱。將成分-靶點關聯信息上傳到 Cytoscape 3.7.2軟件，構建甘草成分-靶點網絡。

1.3 UC蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

通過CTD(comparative toxicogenomics database)數據庫找出與UC相關的基因。采用Venny 2.1軟件選取甘草活性成分作用靶點與UC相關基因的交集，上傳至在線STRING 10.0軟件，得到交集蛋白之間的PPI數據。將PPI數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建PPI網絡圖。

1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將篩選出的交集蛋白導入Cytoscape 3.7.2軟件，利用軟件中的ClueGO插件進行KEGG通路富集分析。

1.5 成分-靶點-信號通路網絡構建

將篩選出的交集蛋白及相關聯的甘草成分相互作用信息上傳到Cytoscape 3.7.2 軟件中，構建與UC相關的甘草成分-靶點網絡圖。再將篩選出的交集蛋白與KEGG富集得到的信號通路關聯信息導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建出UC相關靶點-通路網絡圖。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge 功能將以上2種網絡合并，得出成分-靶點-信號通路網絡圖。

2 結果

2.1 甘草入血活性成分篩選

利用TCMSP篩選出甘草入血活性成分共92種，見表1(僅列出其中20項)。

表1 甘草部分活性成分

2.2 甘草成分-靶點網絡構建

利用TCMSP查詢與活性成分相關的靶蛋白，并使用UniProtKB查詢出靶蛋白對應靶基因的規范名稱，部分活性成分的靶點信息見表2。最終將成分-靶點的關聯數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，得出甘草成分-靶點網絡圖(圖1)。成分-靶點網絡中共有319個節點、1765條邊。甘草中共篩選出92個化合物。與節點相連的邊越多，節點的度值越高。度值較高的節點位于網絡中心，在網絡中的作用較強，該節點的形狀也相應較大。其中槲皮素有152個作用靶點，芒柄花黃素有39個作用靶點。此外，網絡中度值較高的成分還有山柰酚、異鼠李素、柚皮素等。這些具有較多靶點的成分可能是甘草發揮藥理作用的核心成分。從甘草成分-靶點網絡圖中可以得出，甘草是通過多成分、多靶點發揮藥理作用，符合中藥治療疾病的系統性和整體性。

表2 甘草活性成分部分靶點信息

注：綠色四邊形代表甘草活性成分；紫色圓形代表作用靶點。

2.3 PPI網絡構建

在CTD數據庫中輸入疾病名稱“潰瘍性結腸炎”，找出UC相關的蛋白114個。其中41個與甘草成分作用靶點相同，為甘草成分作用靶點與UC相關蛋白的交集蛋白。將41個交集蛋白上傳至在線STRING 10.0軟件，得到交集蛋白之間的相互作用關系。將相互作用關系數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建PPI網絡，見圖2。圖中包括41個交集蛋白節點(藍色六邊形)及535條邊。由圖2可以看出，與其他靶點有較多相互作用的靶點為腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-6(IL-6)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)及血管內皮生長因子A(VEGFA)等。

2.4 KEGG通路富集分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件中ClueGO插件對甘草作用靶點與UC相關蛋白的交集蛋白進行KEGG通路富集分析。將所涉及的41種蛋白質導入Cytoscape 3.7.2軟件，通過KEGG富集分析探討甘草治療UC所涉及的信號通路。通過分析發現，這些靶點共涉及IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、阿米巴病(Amoebiasis)信號通路、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)通路、癌癥信號通路(pathways in cancer)、流體剪切力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、細胞因子與細胞因子受體的相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等28條信號通路。這些信號通路與UC密切相關，具體信息見圖3。

注：基因數表示導入的基因與該信號通路相關的個數；柱上的數字表示與該信號通路相關的導入基因占所有與該信號通路相關基因的百分比。

2.5 成分-靶點-信號通路網絡

利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge 功能將甘草活性成分與交集蛋白及代謝通路之間相互作用關系合并，構建出甘草活性成分-作用靶點-代謝通路網絡，見圖4。圖4中包括甘草活性成分84種、UC相關靶點 41個、信號通路28條。篩選出的甘草活性成分的作用靶點分布在不同的信號通路，相互協調，通過調控不同的信號通路發揮治療UC的作用。成分-靶點-信號通路網絡顯示，甘草中有槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素、異鼠李素等84個活性成分與TNF、IL-6、MAPK3、VEGFA、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、一氧化氮合酶2(NOS2)、過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARG)、糖原合成酶激酶-3β(GSK3B)等41個UC相關蛋白存在較強的相互作用。通過網絡富集發現，這些靶點主要集中在IL-17信號通路、阿米巴病信號通路及炎癥性腸病通路等28條信號通路，參與調控UC病理過程的不同環節。

注：粉紅色四邊形代表甘草活性成分；綠色圓形代表共有靶點；淡藍色矩形代表信號通路。

3 討論

本研究采用網絡藥理學方法，初步建立了甘草治療UC的成分、作用靶點及相關聯的生物學通路網絡。利用TCMSP、CTD等數據庫研究發現，甘草中共含有92個活性成分，存在227個靶點。這227個靶點中共有41個靶點與UC相關，而92種化學成分中有84種與UC相關。將與UC相關靶點進行KEGG 通路富集，結果發現，這些靶點涉及28條生物學通路，參與調控UC病理過程的不同環節。

通過分析成分-靶點-信號通路網絡，預測甘草中參與治療UC的化學成分為槲皮素、芒柄花黃素、山柰酚、異鼠李素、柚皮素等84個成分。相關研究表明，槲皮素可通過調節細胞因子釋放及阻斷信號轉導子和轉錄激活子通路的激活而有效抑制炎癥反應的發生，進而治療UC[11]；芒柄花黃素可通過激活核轉錄因子E2相關因子2(Nrf2)的表達防止UC的發生[12]。這84個活性成分與41個UC相關蛋白存在較強的相互作用，通過網絡富集發現，這些靶點主要集中在IL-17、炎癥性腸病通路及阿米巴病信號通路等28條信號通路。Ogawa等[13]研究發現，阻斷體內IL-17活性可增強小鼠UC的發展，表明IL-17在UC發展中具有抑制作用。另有研究表明，炎癥性腸病可增加大腸癌的風險，包括2種主要的亞型，即UC和克羅恩病[14-15]。由此可知，甘草中多種成分通過作用于多個靶點、調控多條生物學通路發揮治療UC的作用，這也體現出中藥治療疾病的整體性與系統性。

本研究從網絡藥理學角度出發，初步闡述了甘草治療UC的潛在活性成分、可能作用的靶點及發揮藥效的生物學通路，初步揭示了甘草治療UC的相關機制，為進一步深入研究其藥理作用機制提供參考。本研究只是通過數據挖掘對甘草治療UC的作用機制進行了預測，還需要通過藥理和臨床實驗進一步驗證。