忘憂安神方標準煎液HPLC指紋圖譜建立及4種成分含量測定△

汪莉，賈妙婷，孫天雄，馮慧敏，李玥，祝健鴻，何軍剛，李波，強正澤，李成義

甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000

傳統湯劑在中醫臨床應用中較為廣泛且療效顯著，但其制備、攜帶不便，服用劑量大。在中藥新劑型的研發和生產過程中，保證其成品與傳統湯劑的化學和生物等效性是劑型變革的核心，用適宜的方法和標準評價現代制劑質量與傳統湯劑的一致性，有助于保障中醫臨床用藥更加安全有效[1]。標準湯劑、標準煎液、物質基準均是以中醫理論為指導，保持原方療效為目的，以傳統制法為依據，經統一化、標準化工藝制備而成的制劑中間體[2-4]，在融合現代制備工藝的基礎上極大限度保存了傳統湯劑的完整性，其代表了制劑的整體內在質量，以這個中間體為基礎，可實現對制劑原料藥的追溯以及向成品制劑的延伸，是經典名方乃至所有中藥及其復方制劑研發的基準[5]，可用于評價制劑的制備工藝、藥效和質量標準，是現代中藥研究的熱點與發展趨勢[6]。

甘麥大棗湯出自醫圣張仲景的《金匱要略》，為安神劑，具有養心安神、和中緩急之功效，主治情志不舒、思慮過度、躁擾不寧的臟躁癥[7]。現代研究表明[8]，甘麥大棗湯具有鎮靜、催眠、抗抑郁等藥理作用。忘憂安神方是以經典名方甘麥大棗湯為基礎方，由甘肅地產藥材黃花菜及梔子等多味藥食同源的中藥組方而成。方中君藥黃花菜，又名金針菜、忘憂草等，味甘而微涼。《本草綱目》記載其有利濕熱、寬胸膈、安五臟、安寐解郁，治酒疸等作用[9]。該藥與方中其他藥合用，共奏滋陰降火、舒肝和胃、養心安神、平衡陰陽之功效。對目前社會環境因素影響及工作強度加大導致人群中出現的身體乏力、消化功能減弱、睡眠質量下降等亞健康問題具有較好的臨床療效。

本課題組前期已優化處方標準煎液提取工藝，方法穩定，擬開發為療效持久、服用劑量小、質量穩定、攜帶方便、更易于被患者所接受的口服液制劑。為了保證忘憂安神方后續研發的口服液制劑能保持原方的療效與特點，有必要建立原組方標準煎液的質量控制方法。本研究遵循經典名方遵古溯源的研究思路[10]，以復方標準煎液為切入點，采用高效液相色譜法(HPLC)建立忘憂安神方標準煎液指紋圖譜，通過單味藥及陰性樣品指紋圖譜對其中的色譜峰進行溯源研究，以獲得專屬的、整體的化學特征綜合信息，并結合多指標成分測定[11]，建立忘憂安神方全面、有效而切實可行的質量評價體系，為后期成品口服液制劑的質量標準研究及飲片-標準煎液-成品制劑的量值傳遞相關性研究奠定基礎，同時，可為基于中藥標準煎液的中藥臨床驗方研究及新藥開發提供有益的研究經驗和技術參考。

1 材料

1.1 儀器

Aglient 1260型二極管陣列檢測器(DAD)高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；CAV214C型電子分析天平(美國奧豪斯公司)；80-1型電動離心機(金壇市恒豐儀器廠)；YRE-301型旋轉蒸發儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)；98-1-B型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；Milli-Q Century型超純水機。

1.2 試藥

對照品梔子苷(批號：Y25J9C53637)、甘草苷(批號：Z28M10X84164)、槲皮苷(批號：P19D10F106420)、甘草酸銨(批號：P13A9L67602)均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%；乙腈(批號：20200302)、磷酸(批號：20160307)均購自天津大茂化學試劑廠，均為色譜純。

收集忘憂安神方處方飲片各10批，其中黃花菜購于各地藥材市場，其在《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版中未記載，經甘肅中醫藥大學藥學院李成義教授鑒定為百合科萱草屬植物黃花菜HemerocalliscitrinaBaroni的干燥花蕾；其余飲片采購于各大零售藥店，經前期的鑒定及初步質量評價，均符合《中國藥典》2015年版規定。

2 方法與結果

2.1 全方含量測定方法建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～22%A；15～26 min，22%～34%A；26～34 min，34%～60%A；34～42 min，60%～70%A；42～45 min，70%～5%A)；記錄時間為 45 min；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：237 nm(梔子苷、甘草苷)、254 nm(槲皮苷、甘草酸)；進樣量：10 μL。

2.1.2混合對照品制備 分別精密稱取梔子苷6.14 mg、甘草苷0.92 mg、槲皮苷1.95 mg、甘草酸銨2.32 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為梔子苷614 μg·mL-1、甘草苷92 μg·mL-1、槲皮苷195 μg·mL-1、甘草酸銨232 μg·mL-1的混合對照品母液，備用。

2.1.3供試品溶液制備 分別稱取忘憂安神方處方飲片隨機組方 T1～T10，按課題組前期研究標準煎液最佳提取工藝，即加 10倍量水，浸泡1 h，武火煮沸后改用文火，煎煮3次，每次1 h，濾過；合并濾液，濃縮并定容至500 mL(生藥量為0.31 g·mL-1)，得全方標準煎液，精密量取標準煎液2 mL，加70%甲醇8 mL，稱質量，超聲30 min，補足減失的質量，5000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，上清液過0.45 μm濾膜，既得供試品溶液。

1.學生明確體育訓練目的，形成正確的體育訓練動機。體育訓練的目的與體育訓練的動機是緊密聯系的。教師應重視加強體育訓練目的和意義的教育，啟發引導，注意培養學生的內在動力，才能培養學生體育訓練的興趣。只有使學生形成正確的體育訓練動機，才能發揮學生的主體作用。

2.1.4方法學考察

2.1.4.1線性關系考察 分別精密量取混合對照品母液 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL于5 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，得到系列混合對照品溶液，用 0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣。以各對照品的質量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標，峰面積值(Y)為縱坐標，通過計算，得線性方程，結果表明，各對照品在相應濃度范圍內線性關系良好，見表1。

表1 忘憂安神方標準煎液中4種成分的線性關系

2.1.4.2精密度試驗 取T1供試品溶液，連續進樣6次，按2.1.1項下色譜條件進樣檢測，得各指標性成分保留時間RSD均小于1%，峰面積的RSD均小于4%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3穩定性試驗 取T1供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、36 h，按2.1.1項下色譜條件進樣檢測，得各指標性成分保留時間RSD均小于1%，含量RSD均小于3%，表明各指標成分在36 h內穩定性良好。

2.1.4.4重復性試驗 取T1供試品溶液6份，按2.1.1項下色譜條件進樣檢測，得各指標性成分保留時間RSD均小于1%，峰面積RSD均小于3%，表明儀器重復性良好。

2.1.4.5加樣回收率試驗 精密量取已知含量的T1標準煎液2 mL，加入適量的各對照品溶液，按2.1.3項下方法制備，按2.1.1項下色譜條件進樣檢測，計算4種指標成分的平均加樣回收率為95%～105%，RSD均小于3%，見表2。

表2 忘憂安神方標準煎液中4種成分含量測定的加樣回收率試驗結果(n=6)

2.2 10批標準煎液含量測定

取上述10批忘憂安神方標準煎液T1～T10，按照2.1.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項下色譜條件進行進樣分析，記錄色譜峰，分別代入回歸方程，計算10批忘憂安神方標準煎液中梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸含量，結果見表3、圖1。結果表明，10批忘憂安神方標準煎液中梔子苷質量分數為36.84～55.86 mg·g-1、甘草苷質量分數為3.96～6.57 mg·g-1、槲皮苷質量分數4.59～13.76 mg·g-1、甘草酸質量分數為16.64～21.14 mg·g-1，不同批次間4種成分含量差異較大，表明不同批次的原藥材質量存在差異。

表3 10批忘憂安神方標準煎液中4種成分的含量測定結果 mg·g-1

圖1 混合對照品和忘憂安神方標準煎液供試品溶液的HPLC圖

2.3 全方標準煎液指紋圖譜建立

2.3.2對照品制備 精密吸取2.1.2項下對照品母液1 mL，加甲醇定容至5 mL，制成質量濃度分別為梔子苷122.8 μg·mL-1、甘草苷18.4 μg·mL-1、槲皮苷39 μg·mL-1、甘草酸銨46.4 μg·mL-1的混合對照品溶液，既得。

2.3.3供試品溶液制備

2.3.3.1全方供試品制備 分別精密量取2.1.3項下標準煎液T1～T10各2 mL，加蒸餾水定容至10 mL，5000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，上清液過0.45 μm濾膜，既得全方指紋圖譜供試品溶液。

2.3.3.2單味飲片溶液制備 按照各單味藥在全方中的配比，分別稱取各單味藥，按2.3.3.1項下方法制備單味飲片供試品溶液。

2.3.3.3陰性樣品溶液制備 分別稱取除各單味藥的其余藥材，按2.3.3.1項下方法，制備缺各單味藥的陰性對照溶液。

2.3.4方法學考察

2.3.4.1精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液(T1)，按2.3.1項下色譜條件連續進樣 6 次，記錄色譜圖。以峰面積較大、出峰時間穩定的梔子苷為參照峰，計算得到各特征峰相對保留時間的RSD<0.5%，相對峰面積的RSD<3%，相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(T1)，按2.3.1下色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖。以梔子苷為參照峰，計算得到各特征峰相對保留時間的 RSD<0.5%，相對峰面積的 RSD<3.0%，相似度均大于0.99，表明供試品溶液在 24 h 內穩定性良好。

2.3.4.3重復性試驗 精密吸取6份T1的樣品溶液，按2.3.3.1項下方法制備供試品溶液 6 份，再按2.3.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以梔子苷為參照峰，計算得到各特征峰相對保留時間的RSD<0.2%，相對峰面積的RSD<3.0%，相似度均大于0.99，表明方法具有較好的重復性。

2.4 10批標準煎液指紋圖譜相似度評價及色譜峰歸屬和指認

2.4.1指紋圖譜相似度評價 按照2.3.1項下色譜條件，對10批標準煎液進行指紋圖譜測定，記錄圖譜。將10批標準煎液的指紋圖譜測定結果以AIA格式依次導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012年版)，以S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.2 s，通過多點校正后，采用平均數相關系數法進行圖譜自動匹配，生成10批樣品共有模式圖譜，10批標準煎液的 HPLC指紋圖譜及其共有模式圖譜(R)見圖2。進行相似度計算，結果顯示，10批樣品與對照指紋圖譜相似度分別為0.985、0.967、0.943、0.988、0.975、0.988、0.989、0.976、0.987、0.995。說明樣品制備方法及所建立指紋圖譜穩定可靠，能反映忘憂安神方標準煎液整體特征，可作為其質量控制的參照依據。

圖2 10批忘憂安神方標準煎液指紋圖譜及其對照指紋圖譜

2.4.2共有峰確立及指標成分標定 對10 批次忘憂安神方標準煎液 HPLC 共有模式圖譜進行分析后，確定了36個共有峰。通過與混合對照品圖譜比對，確定17號峰對應梔子苷，24號峰對應甘草苷，26號峰為槲皮苷，35號峰對應甘草酸，見圖3。

注：17.梔子苷；24.甘草苷；26.槲皮苷；35.甘草酸。

2.4.3色譜峰歸屬分析 取各單味藥溶液、陰性供試品溶液、全方供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進行測定，記錄各色譜圖。將各單味藥、陰性、全方共有模式色譜峰進行匹配，同時比對各共有峰保留時間及紫外光譜圖，確定各共有峰歸屬。結果顯示，各單味藥對共有峰的貢獻程度有所差異，君藥黃花菜及梔子、甘草、合歡花4味藥對共有峰貢獻較大，其他各味藥對共有峰貢獻不大，但在指紋圖譜中均有體現，表明所建立的指紋圖譜可以反映忘憂安神方主要藥效物質組成。

3 討論

本研究建立了忘憂安神方中4種成分的 HPLC含量測定方法及指紋圖譜質量評價方法，考察確定了指標性成分的選擇、提取溶劑、色譜條件。

3.1 指標成分選擇

為了與傳統湯劑保持一致，本研究標準煎液的提取以水為溶媒，并結合與忘憂安神方處方組成相似的復方制劑相關的研究及《中國藥典》2015年版中飲片含量測定指標[12-13]，確定性質穩定且水溶性較好、含量相對較高且具有解郁安神作用的梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸4種成分作為含量測定成分[14-16]，同時，這4種成分具有較好的專屬性，梔子苷為梔子的指標性成分，甘草苷、甘草酸為甘草的指標性成分，槲皮苷為合歡花的指標性成分，建立其含量測定的方法，可為后期忘憂安神方中梔子、甘草、合歡花飲片-標準煎液-成品制劑的轉移率研究奠定基礎。

3.2 提取溶劑

含量測定時分別考察了水、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇、50%甲醇作為提取溶劑，結果發現，70%甲醇作為提取溶劑時4種成分的含量相對較高，故最終確定70%甲醇為含量測定提取溶劑。

3.3 色譜條件

在含量測定波長選擇過程中，DAD對梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸銨對照品進行全波長掃描(190～400 nm)，結果梔子苷、甘草苷在237 nm左右有最大吸收，槲皮苷、甘草酸的最大吸收波長分別為256、252 nm。綜合分析將237 nm作為梔子苷、甘草苷含量測定波長，254 nm作為槲皮苷、甘草酸含量測定波長。

由于大多數化學成分在254 nm均有紫外吸收，故在指紋圖譜的前期研究過程中選擇254 nm作為指紋圖譜測定波長，結果梔子苷與其他色譜峰相應值差別較大，因此，選擇254 nm附近的波長：250、252、256、258、260、265 nm，最終發現260 nm下各色譜峰響應值均較高，峰形較好且基線平穩，故確定指紋圖譜測定波長為260 nm。

流動相分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.1%甲酸的洗脫效果。結果乙腈-水的色譜峰的數量少且峰形不好，加入適量的酸后色譜峰變得豐富，而含0.1%甲酸流動相洗脫后色譜峰分離度略優于0.1%磷酸。增加甲酸含量至0.2%后，色譜峰峰形及分離度幾乎沒有變化，由于酸性過強容易對色譜柱造成損耗，最終確定選擇乙腈-0.1%甲酸作為指紋圖譜流動相。

目前，很多學者致力于單味藥材-飲片-標準湯劑-配方顆粒的研究[17-20]，也有少數學者對于經典名方標準湯劑(物質基準)進行研究[21-22]。中藥用藥講求君臣佐使，即復方配伍的湯劑是中藥用藥的主要形式，本研究以復方標準煎液為模式標準，選擇指紋圖譜結合多指標成分定量分析的方法，建立忘憂安神方的質量控制技術及評價體系，在明確臨床患者所用煎服湯劑的藥學品質的基礎上，進一步將這一標準用于后續的制劑研發和生產上，通過對飲片-標準煎液-成品制劑進行出膏率、指標成分轉移率的快速測定及指紋圖譜相似度分析，實現對單味飲片-中間體-成品制劑的量值傳遞相關性研究及制劑生產全過程質量控制，縮小成品制劑的批間差異，以保證制劑的有效物質群和質量基本穩定。另外，通過將各單味飲片中各成分信息與全方標準煎液的比較，能夠更好地提升中藥配伍、組方的科學性和規范性。