大別山紅天麻飲片多指標(biāo)質(zhì)量標(biāo)志物研究△

耿文潔，汪聰聰，劉勁松，桂雙英，彭代銀，王舉濤，2*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012

天麻為蘭科天麻屬寄生植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖，是我國(guó)沿用已有一千多年歷史的傳統(tǒng)滋補(bǔ)名貴中藥材之一，且可藥食兩用[1]。天麻性平，味甘，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)通絡(luò)、平抑肝陽等功效[2]，主要用于肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、驚癇抽搐、眩暈、頭痛及中風(fēng)手足不遂、風(fēng)濕痹痛等證。我國(guó)天麻可分為5種變型：紅天麻、綠天麻、烏天麻、松天麻和黃天麻[3]。安徽大別山地區(qū)主產(chǎn)紅天麻，其為天麻的原變型，具有很高的研究?jī)r(jià)值。

質(zhì)量標(biāo)志物主要依據(jù)中藥屬性、制造過程及配伍理論等特點(diǎn)提出，是中藥及中藥復(fù)方質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分[4-5]。以1～2種活性成分或指標(biāo)成分進(jìn)行定性定量分析的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式已經(jīng)不能滿足中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的要求，多指標(biāo)綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)模式已成為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的新需求，也是新的研究趨勢(shì)[6-8]。本研究通過一測(cè)多評(píng)(QAMS)研究大別山紅天麻質(zhì)量標(biāo)志物及特征圖譜，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊設(shè)備廠)；AUW220D型分析天平、LC-10AD型日本島津高效液相色譜儀(Shimadzu)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市朗博儀器制造有限公司)；AnkeTGL-16G型離心機(jī)(上海安亭儀器科學(xué)儀器廠)；KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀；Waters1525型高效液相色譜儀。

1.2 試藥

對(duì)照品天麻素(批號(hào)：DST180411-013)、腺苷(批號(hào)：DST181110-047)、5-羥甲基糠醛(批號(hào)：DST180709-056)、對(duì)羥基苯甲醇(批號(hào)：DST181216-123)、對(duì)羥基苯甲醛(批號(hào)：DST190512-129)、巴利森苷A(批號(hào)：DST180419-102)、巴利森苷E(批號(hào)：DST190214-066)純度≥98%；對(duì)照品巴利森苷B(批號(hào)：DST190214-063)、巴利森苷C(批號(hào)：DST190214-064)純度≥97%；對(duì)照品對(duì)羥基苯甲酸(批號(hào)：DST180506-114，純度≥99%)，以上對(duì)照品均購(gòu)自成都德斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸均為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

從大別山地區(qū)分別收集10批紅天麻飲片，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山副教授鑒定為蘭科天麻屬植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖。留樣均保存于安徽中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。樣品信息見表1。

表1 10批紅天麻飲片產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～21 min，3%～5%A；21～42 min，5%～14%A；42～56 min，14%A；56～60 min，14%～20%A；60～65 min，20%～34%A；65～78 min，34%～95%A；78～83 min，95%～3%A；83～90 min，3%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。在此條件下，9種質(zhì)量標(biāo)志物與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，見圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.供試品(批號(hào)：201812001Y)；1.腺苷；2.天麻素；3.對(duì)羥基苯甲醇；4.對(duì)羥基苯甲酸；5.對(duì)羥基苯甲醛；6.巴利森苷 E；7.巴利森苷 B；8.巴利森苷 C；9.巴利森苷 A；圖2同。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸、巴利森苷 A、巴利森苷 B、巴利森苷 C、巴利森苷 E 對(duì)照品各適量，加30%乙腈，制成質(zhì)量濃度分別為0.127 0、0.180 6、0.017 5、0.001 5、0.000 9、0.238 0、0.135 0、0.047 0、0.113 2 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，搖勻，于冰箱中避光保存，備用，濾過，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取紅天麻飲片粉末(過三號(hào)篩)約0.4 g，精密稱定，置50 mL圓底燒瓶中，精密加入3%乙腈25 mL，稱定質(zhì)量；置于85 ℃的水浴鍋中，回流0.5 h，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、6、8、10、12 μL注入液相色譜儀。以各對(duì)照品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。結(jié)果表明，9種質(zhì)量標(biāo)志物成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 大別山紅天麻飲片線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品(批號(hào)：201812001Y)溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各組分色譜峰面積。結(jié)果表明，腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷 C、巴利森苷 E的峰面積 RSD分別為1.26%、1.44%、0.59%、0.91%、0.73%、0.22%、0.21%、0.83%、0.35%，結(jié)果RSD均小于2%，表明儀器的精密度較好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(批號(hào)：201812001Y)溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、24 h 進(jìn)樣 10 μL，測(cè)得腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E峰面積的RSD分別為1.21%、1.56%、0.55%、1.06%、1.06%、0.28%、0.32%、0.58%、0.22%，結(jié)果RSD均小于2%，說明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同批次大別山紅天麻飲片(批號(hào)：201812001Y)粉末(過三號(hào)篩)約0.4 g，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備，平行制備6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為1.05%、1.23%、0.46%、1.29%、1.54%、0.73%、0.68%、0.48%、0.58%，結(jié)果RSD均小于2%，表明重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定的大別山紅天麻飲片粉末(過三號(hào)篩)約0.2 g，加入一定量的混合對(duì)照品溶液，平行制備6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸、巴利森苷 A、巴利森苷 B、巴利森苷 C、巴利森苷 E的平均加樣回收率分別為98.33%、101.85%、101.06%、98.59%、97.46%、96.86%、100.74%、102.21%、99.02%，RSD分別為1.57%、1.10%、1.49%、1.67%、1.54%、1.31%、1.49%、1.23%、1.61%。

2.5 QAMS含量測(cè)定

2.5.1相對(duì)校正因子的計(jì)算 以天麻素為內(nèi)標(biāo)，按公式(1)計(jì)算其他8種成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表3。

表3 腺苷等8種成分相對(duì)校正因子

fk/m=fk/fm=(Ck×Am)/(Cm/Ak)

(1)

式中f代表相對(duì)校正因子，k代表內(nèi)標(biāo)物，m代表其他組分，Ck為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cm為其他組分的質(zhì)量濃度，Am為其他組分的峰面積。

2.5.2相對(duì)校正因子的耐用性考察

2.5.2.1不同儀器對(duì)f的影響 考察Waters、Thermo、島津3個(gè)品牌的高效液相色譜儀對(duì)f的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同儀器對(duì)紅天麻飲片中8種成分相對(duì)校正因子的影響

2.5.2.2不同色譜柱對(duì)f的影響 考察Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo Hypersil GOLD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對(duì)f的影響，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，f對(duì)不同品牌色譜柱具有良好的適應(yīng)性。

表5 不同色譜柱對(duì)紅天麻飲片中8種成分相對(duì)校正因子的影響

2.5.310批次樣品含量測(cè)定結(jié)果 取10批大別山區(qū)產(chǎn)紅天麻樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定其9 種質(zhì)量標(biāo)志物成分的含量，結(jié)果見表6。10 批樣品中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為腺苷22.347～26.557 mg·g-1、天麻素8.080～10.320 mg·g-1、對(duì)羥基苯甲醇4.629～8.301 mg·g-1、對(duì)羥基苯甲酸0.638～1.627 mg·g-1、對(duì)羥基苯甲醛3.298～6.633 mg·g-1、巴利森苷E 13.594～19.905 mg·g-1、巴利森苷B 18.029～24.480 mg·g-1、巴利森苷C 4.942～6.921 mg·g-1、巴利森苷A 25.939～31.147 mg·g-1。

表6 10 批紅天麻飲片樣品中9 種質(zhì)量標(biāo)志物含量測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1

2.6 特征圖譜

2.6.1共有峰的確定 分別取10批大別山紅天麻樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，生成大別山紅天麻全譜峰匹配圖，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了 10個(gè)共有峰，1號(hào)峰(4.34 min)為腺苷，2號(hào)峰(7.63 min)為天麻素，3號(hào)峰(9.967 min)為5-羥甲基糠醛，4號(hào)峰(12.62 min)為對(duì)羥基苯甲醇，5號(hào)峰(23.25 min)為對(duì)羥基苯甲酸，6號(hào)峰(30.75 min)為對(duì)羥基苯甲醛，7號(hào)峰(31.96 min)為巴利森苷E，8號(hào)峰(44.52 min)為巴利森苷B，9號(hào)峰(47.45 min)為巴利森苷C，10號(hào)峰(60.39 min)為巴利森苷A。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于2%，相對(duì)峰面積RSD 存在一定的差異。

2.6.2特征圖譜相似度評(píng)價(jià) 取10 批大別山紅天麻樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A版)”進(jìn)行指紋圖譜分析，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配(時(shí)間窗為0.1 min)，用中位數(shù)法生成指紋圖譜，結(jié)果見圖 2～3。10批大別山紅天麻樣品色譜圖與對(duì)照?qǐng)D譜相似度分別為0.999、0.989、0.999、0.992、0.995、0.988、0.988、0.989、0.993、0.999。

圖2 10批大別山紅天麻特征圖譜匹配圖

注：1.腺苷；2.天麻素；3.5-羥甲基糠醛；4.對(duì)羥基苯甲醇；5.對(duì)羥基苯甲酸；6.對(duì)羥基苯甲醛；7.巴利森苷 E；8.巴利森苷 B；9.巴利森苷 C；10.巴利森苷 A。

3 討論

3.1 提取方式考察

分別用甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、3%乙腈超聲處理，結(jié)果表明，使用流動(dòng)相3%乙腈直接超聲處理提取效率最高，故選擇3%乙腈作為提取溶劑。對(duì)比用流動(dòng)相3%乙腈回流和超聲提取的樣品，確立加熱回流作為其提取方式，特征峰信息豐富。

3.2 色譜條件選擇

采用DAD檢測(cè)器在190～400 nm對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果 9個(gè)成分在270 nm處均有較大吸收，確定測(cè)定波長(zhǎng)為270 nm。再分別對(duì)甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液的流動(dòng)相體系進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，乙腈-0.2%磷酸溶液系統(tǒng)色譜峰響應(yīng)最好、分離度高、基線平穩(wěn)，故最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液。同時(shí)，還對(duì)流速、柱溫進(jìn)行了考察，分別考察了柱溫20、25、30、35 ℃，以及流速0.8、1.0、1.2 mL·min-1下的分離效果，結(jié)果顯示，在柱溫30 ℃、流速1.0 mL·min-1條件下色譜峰分離效果最優(yōu)，故選擇在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4 展望

本研究建立天麻素與對(duì)羥基苯甲醇類及巴利森苷類成分等多指標(biāo)質(zhì)量標(biāo)志物評(píng)價(jià)模式，選用性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉的天麻素為內(nèi)標(biāo)物，建立大別山紅天麻中9個(gè)質(zhì)量標(biāo)志物的QAMS，同時(shí)建立了特征圖譜，指認(rèn)了其中10個(gè)色譜峰，為今后大別山紅天麻的質(zhì)量控制提供參考。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，天麻素與對(duì)羥基苯甲醇類及巴利森苷類成分有相互轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。