基于多成分含量測定及HPLC 指紋圖譜結合化學計量學方法評價百合質量△

楊揚宇，陳林，唐雪陽，蔡萍，唐正平，張水寒*

1.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410013；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南春光九匯現代中藥有限公司，湖南 瀏陽 410300

百合為百合科百合屬植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.、百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker 或細葉百合L.pumilumDC.的干燥肉質鱗葉[1]，具有滋陰清肺、化痰止咳、寧心安神的功效，收載于《中華人民共和國藥典》2015年版，是最具代表性的藥食兩用中藥之一[2]。百合主要含有酚性甘油酯、多糖、生物堿、甾體皂苷類等活性成分。與多糖、皂苷類相比，酚性甘油酯類含量相對較低，卻是百合發揮抗氧化、抗腫瘤、調節免疫等作用的重要活性成分，與百合養肺陰、補肺氣功效緊密相關[3-7]。基于團隊前期研究發現，王百合苷類物質含量在炮制前后的百合中差異有統計學意義[8]。此外，據文獻報道，這一類成分的含量與百合品種和產地等因素均有一定關系[3，9]，其中，報道較多的酚性甘油酯類包括王百合苷B、王百合苷C、王百合苷E、王百合苷F、1-O-阿魏酰甘油等。這些成分或可作為鑒別不同品種和產區百合的關鍵成分。利用中藥指紋圖譜作為質量控制指標的方法，分析不同產地的多個樣本，可以有效控制百合藥材質量[9-12]。本研究建立了百合高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，同時針對百合中3種酚性甘油酯成分進行含量測定，結合化學計量學分析，評價我國百合藥材主產地湖南、江西、安徽等地栽培品種的質量，為百合質量控制與開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

KQ5200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LC-20AT型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A型二極陣列檢測器、SIL-20A型自動進樣器、CTO-10AS VP型柱溫箱[島津儀器(中國)有限公司]；AL204型電子天平、XPE105型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥

采集了21份百合樣本，并經湖南省中醫藥研究所劉浩助理研究員鑒定為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.的干燥肉質鱗葉，憑證標本存放于湖南省中醫藥研究院中藥研究所。樣品產地信息見表1。

表1 21批百合樣品信息

對照品王百合苷C(純度：99.9%，批號：P20D10F106515)、王百合苷E(純度：99.2%，批號：P08J11F107953)、王百合苷B(純度：99.6%，批號：P28S10F99182)均購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜純，美國天地有限公司)；磷酸(分析純，天津市恒興化學試劑)；甲醇(分析純，湖南匯虹試劑有限公司)；純凈水(華潤怡寶飲料有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動相：乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)梯度洗脫(0～2 min，5%～13%A；2～17 min，13%～15%A；17～37 min，15%～20%A；37～42 min，20%～100%A)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1對照品溶液的制備 取王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B對照品適量，精密稱定，分別置于量瓶中，加80%甲醇溶解，制成質量濃度分別為521、499、1046 μg·mL-1的對照品儲備液。

2.2.2供試品溶液制備 取21批次的樣品粉末(過四號篩)約 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80% 甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理 30 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1精密度試驗 取百合供試品(S10)溶液，按2.1項下色譜條件重復進樣6次。以26號王百合苷E色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間 RSD 均小于 1%，相對峰面積 RSD 均小于 3%。表明儀器精密度良好。

2.3.2穩定性試驗 取百合供試品(S10)溶液，按2.1項下色譜條件分別在 0、1、2、4、8、12 h 進樣分析。以 26 號王百合苷E色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間 RSD 均小于 1%，相對峰面積 RSD 均小于 3%。表明供試品溶液的成分在室溫放置在12 h內穩定。

2.3.3重復性試驗 平行取百合供試品(S10)6 份，按2.2項下供試品溶液的配制方法處理，按2.1項下色譜條件測定。以 26 號王百合苷E色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰相對保留時間 RSD 均小于 1%，相對峰面積RSD 均小于3%。表明該方法重復性良好。

2.3.4線性關系考察 分別精密吸取2.2.1項下王百合苷C、王百合苷E對照品儲備液0.1、0.3、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取2.2.1項下王百合苷B對照品儲備液 0.1、1.0、1.9、2.8、3.7、4.6、5.5 mL分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻。按2.1項下色譜條件依次進樣分析，記錄色譜圖和峰面積，以各對照品溶液質量濃度為橫坐標(X)，其所對應的峰面積為縱坐標(Y)，各成分回歸方程、相關系數及線性范圍見表2。結果表明，王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B質量濃度分別為5.21～104.20、4.99～99.8、10.46～575.30 μg·mL-1時呈現良好的線性關系。

表2 3種王百合苷含量線性關系考察結果

2.3.5加樣回收率試驗 平行稱取1 g已知含量的樣品(S10)9份，精密稱定，按已知含量的50%、100%、150% 3個水平精密加入對照品，按2.2.2項下方法制備，配制成低、中、高 3個不同質量濃度的供試品溶液，每個質量濃度制備3份，按2.1項下色譜條件進樣分析。計算王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B的平均回收率分別為 101.4%、97.9%、99.2%，RSD分別為 3.82%、1.96%、2.77%。說明該方法的準確性良好。

2.4 百合藥材含量測定

按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件對不同產地的21份百合供試品溶液進樣分析，計算王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B的質量分數，測定結果見表3。王百合苷C平均質量分數為(0.185±0.052)mg·g-1，以安徽產最高，河北產最低；王百合苷E平均質量分數為(0.203±0.054)mg·g-1，以安徽產最高，陜西產最低；王百合苷B平均質量分數為(1.956±0.438)mg·g-1，以江西和安徽產較高，陜西產最低。

表3 21批百合藥材中王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B含量測定結果(n=3) mg·g-1

2.5 百合藥材指紋圖譜的建立與分析

2.5.1指紋圖譜共有峰確定 取21批百合藥材樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下確定的色譜條件進樣測定，得到百合藥材及對照品溶液圖譜(圖1)，使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)”對 21 批百合藥材特征圖譜進行共有峰標識(圖2)，共標識了31個共有峰，并生成對照圖譜(圖3)。

注：A.王百合苷C；B.王百合苷E；C.王百合苷B；D.百合藥材；E.空白對照。

圖2 21批百合藥材HPLC指紋圖譜疊加圖

圖3 百合藥材HPLC對照圖譜

2.5.2指紋圖譜相似度評價結果 以21批百合藥材樣品生成的共有模式(R)為對照指紋圖譜，21批次百合藥材與對照指紋圖譜的相似度分別為0.970、0.986、0.972、0.982、0.990、0.971、0.986、0.973、0.899、0.890、0.925、0.988、0.975、0.988、0.979、0.980、0.977、0.992、0.939、0.925、0.974。相似度結果表明，21批百合指紋圖譜相似度存在一定差異，S9、S10 2批陜西產百合相似度匹配較低，其他各批次相似度均在0.900以上，需結合其他化學計量學方法進一步分析以評價不同產地百合質量。

2.5.3不同產地百合主成分分析(PCA)PCA方法是一種無監督的學習方法[13-14]，能夠從原始數據中提取共有特征并構建成主成分因子；通過主成分因子可以體現樣本間相似性和原始數據對主成分因子的貢獻。本研究以31個共有峰的峰面積為變量，用SPSS 24.0.0.0軟件對21份不同產地的百合進行PCA，特征值及方差貢獻率見表4，碎石圖見圖4。前3個成分的累積方差貢獻率為76.46%，表明前3個主成分能夠充分體現出百合的基本特征和主要信息。結合觀察碎石圖可見PCA中特征值的變化情況，圖中曲線存在1個明顯的拐點，說明前3個主成分的分析結果基本顯示出了不同批次百合藥材之間的相似度和差異性。

表4 百合PCA特征值和方差貢獻率

圖4 百合PCA碎石圖

初始因子載荷矩陣見表5。第一主成分主要反映了來自原始指標色譜峰1～2、4～8、10、12～14、10、16～17、19、23～25的信息，第二主成分主要反映了來自原始指標色譜峰20、22、26～28、30的信息，第三主成分主要反映來自原始指標色譜峰21、29的信息。初始因子載荷矩陣結果顯示，王百合苷C對主成分1的載荷值達到0.708，王百合苷E和王百合苷B對主成分2的載荷值分別為0.625、0.748，表明王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B在特征變量的重要性評估中具有優勢，對百合不同批次間的差異成分有一定貢獻，這與其他團隊研究結果相符合[3]。

表5 百合PCA主要因子載荷矩陣

2.5.4不同產地百合隨機森林分析 采用有監督的隨機森林算法(RFA)[8]，以湖南省為一類，而其他省份為一類進行聚類分析，分析結果見圖5。由圖5可知，來自湖南省的樣本聚集在分類圖的右下角，而其他省份百合聚集在分類圖的上部，RFA對不同省份百合的分類準確率達到85.71%。說明結合HPLC指紋圖譜與模式識別分析，可進一步發現不同產地百合樣本的差異性，為百合質量評價及分析提供參考。

圖5 采用RFA的百合樣本聚類分析

3 討論

3.1 色譜條件確定

本實驗對色譜條件中的流動相體系(乙腈-水、甲酸-水、乙腈-磷酸水、乙腈-甲酸水)、檢測波長(210～350 nm)進行考察。經比較發現，乙腈-0.3%磷酸體系對各色譜峰分離效果最好，選擇了250 nm作為百合藥材指紋圖譜和含量測定波長。對洗脫程序進行優化，最終建立了簡便可行的分析方法。

3.2 供試品溶液制備方法確定

在供試品溶液的制備方法方面，考察了提取溶劑(50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇)、提取方式(超聲、回流)、提取倍量(10、20、30倍)和提取時間(10、20、30 min)，優選出百合藥材的最佳提取方式，即80%甲醇10倍量，超聲提取30 min，可將百合藥材中3種酚性甘油酯成分完全提取，所建立的提取方法穩定、合理。

4 結語

目前，對百合指紋特征圖譜的研究主要通過儀器分析，圍繞百合的品種、產地、炮制加工等因素對藥材質量的影響進行評價，但評價方式較為單一。本研究利用HPLC指紋圖譜形成不同產地百合共有識別模式，表征共有酚性甘油酯成分王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B含量，21批百合對照圖譜相似度存在一定差異。在此基礎上，運用PCA、RFA對百合樣品信息進行深挖。PCA對于指紋圖譜類復雜數據有化繁為簡的降維作用。分析結果表明，王百合苷C、王百合苷E、王百合苷B對百合質量特征有一定貢獻，進一步采用RFA發現，不同產地百合樣本差異。本研究建立的基于HPLC指紋圖譜和化學計量學分析的百合質量評價方式，為不同產地百合差異與質量分析提供依據，為全面評價百合藥材的質量提供了一種切實可行的參考。