基于網絡藥理學的知柏地黃丸治療性早熟機制研究

蔡鍶，黃鋼花

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000；2.廣州中醫藥大學 第一附屬醫院，廣東 廣州 510000

性早熟是指女性在8歲前、男性在9歲前開始出現第二性征發育的疾病，根據是否啟動下丘腦-垂體-性腺軸(HPGA)可分為中樞性性早熟(促性腺激素釋放激素依賴性性早熟，CPP)或外周性性早熟(非促性腺激素釋放激素依賴性性早熟，PPP)。目前，CPP的病因可分為器質性病變及非器質性病變兩大類，其中，不完全性(部分性)性早熟是CPP中的一種特殊類型，表現為孤立的性發育，如單純性乳房早發育、單純性陰毛早發育和單純性早初潮[1]。本研究中涉及的性早熟疾病主要包括CPP和PPP。

《中醫兒科臨床診療指南·性早熟(修訂)》2016年版[2]推薦知柏地黃丸為性早熟主證、兼證的主要治療方劑。目前，已有學者研究了知柏地黃丸治療性早熟的臨床療效[3]。張穗洪[4]采用知柏地黃丸化裁方治療特發性性早熟，能有效降低患兒的性激素水平，改善性早熟的癥狀；劉超等[5]研究發現，知柏地黃丸聯合亮丙瑞林治療女童CPP，可緩解患兒第二性征的發育且不良反應少、安全性高；鄭憐玉等[6]發現，知柏地黃丸治療部分性性早熟，能夠降低其轉為CPP的發生率。然而，每項研究項目的樣本量均較少，普遍質量偏低，尤其未采用盲法及分配隱藏，療程長短不一，各項研究間異質性較大，可能存在發表偏倚等問題[7]。本研究從網絡藥理學角度進行分析，通過尋找知柏地黃丸治療性早熟的靶基因，從分子水平推測其作用機制。

1 材料與方法

1.1 知柏地黃丸成分收集與篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索知柏地黃丸化學成分，并根據成分吸收、分布、代謝和排泄(ADME)參數[8]，選取口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18的成分作為活性成分，建立知柏地黃丸活性成分數據庫。

1.2 知柏地黃丸、性早熟疾病相關靶點與交集靶點獲取

將從TCMSP數據庫中得到的知柏地黃丸靶點導出，并通過UniProt數據庫(http：//www.genecards.org/)矯正為統一官方基因名稱。以“precocious puberty”為關鍵詞在GeneCards數據庫(http：//www.genecards.org/)、OMIM數據庫(online mendelian inheritance in man，https：//omim.org/)搜索性早熟疾病相關基因。將藥物靶點與疾病靶點通過R軟件相互映射，取交集得到藥物-疾病的靶點基因。

1.3 成分-靶點、蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

采用Cytospase 3.3.0(https：//cytoscape.org/)軟件構建活性成分-靶點網絡，節點表示成分和靶標，分別用不同的顏色和不同的形狀的節點(node)代表所對應的成分和作用靶點，邊(edge)表示節點相互作用關系，構建可視化網絡圖。利用Tool工具中Network Analyzer分析網絡拓撲參數，計算相關拓撲參數如節點度值(degree)、介數中心性(betweenness centrality)，取度值和介數中心性綜合排名靠前的活性成分。

將交集靶點導入STRING(http：//stitch.embl.de)數據庫，選擇“multiple proteins”項，物種選擇為“homo sapiens”，獲得蛋白相互作用關系，選取combined score置信度值≥0.9，構建PPI網絡。導出文件，并通過R 3.6.2(https：//www.r-project.org/)軟件計算得到排名前10的PPI網絡核心基因。

1.4 靶點基因基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

以R軟件為平臺，運用“ClusterProfiler”程序包，利用Bioconductor提供的GO注釋信息和KEGG通路數據庫進行信號通路富集分析，物種和背景欄均選擇“homo sapiens”，分析結果包括GO功能分析和KEGG通路分析，以校正后的P<0.05為閾值，篩選顯著富集的生物功能和通路，獲得交集基因主要的生物功能和作用通路。

2 結果

2.1 知柏地黃丸活性成分及其治療性早熟靶點篩選結果

根據OB≥30%和DL≥0.18原則，共篩選得到知柏地黃丸中113種活性成分。其中，熟地黃中2個、茯苓中15個、山茱萸中20個、澤瀉中10個、牡丹皮中11個、山藥中16個、知母中15個、黃柏中37個。依據DL水平列舉出前20種活性成分，見表1。篩選得到知柏地黃丸藥物靶點125個，與性早熟相關的疾病靶點1022個，取藥物與疾病靶點的交集，可得到70個靶點，見圖1。

圖1 知柏地黃丸藥物靶點與性早熟疾病靶點韋恩圖

表1 知柏地黃丸部分活性成分

2.2 成分-靶點網絡構建

將得到的知柏地黃丸成分和其治療性早熟的靶點導入Cytoscope 3.3.0軟件，得到成分-靶點網絡圖(圖2)。該網絡共包含133個節點、276條邊，其中，63個節點代表知柏地黃丸有效成分，70個節點代表與有效成分相關的性早熟治療靶點，網絡平均鄰節點數為4.120。節點的度值表示該節點和網絡中其他節點相連的路線條目，度值越大代表該節點是連接其他節點的重要橋梁[9]。取節點度值和介數中心性綜合排名前5的化合物及排名前9的靶點，見表2～3。

表2 知柏地黃丸成分-性早熟靶點網絡中度值排名前5的化合物

圖2 知柏地黃丸成分-性早熟靶點網絡

2.3 疾病靶點PPI網絡

將性早熟相關的靶點基因導入STRING數據庫，得到疾病PPI網絡，該網絡共有61個節點和140條邊，網絡平均鄰節點數為4.590，網絡中的節點代表靶點，邊表示靶點間的相互作用關系，邊數越多表示該節點對應的靶點在網絡中的作用越重要，見圖3。結果表明，蛋白激酶B1(Akt1)、白細胞介素-6(IL-6)、雌激素受體1(ESR1)、絲裂原活化的蛋白激酶14(MAPK14)、原癌基因c-Fos(FOS)、IL-1β、IL-4、表皮生長因子(EGF)、IL-10、IL-2度值較高，說明這些蛋白在網絡中的作用顯著，是和其他蛋白互通的紐帶，見圖4。

圖3 性早熟疾病PPI網絡

圖4 性早熟疾病PPI網絡核心蛋白

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

通過GO注釋信息和KEGG數據庫進行信號通路富集分析，得到校正后P<0.05的排名前20的生物學功能(核受體活性；轉錄因子活性、直接調控配體特異性的DNA序列結合；氧化還原酶活性、通過結合或還原氧分子作用于配對供體；類固醇激素受體活性；血紅素結合；四吡咯結合；類固醇結合；單加氧酶活性；氧化還原酶活性、通過結合或還原分子氧作用于成對供體，還原黃素或黃素蛋白作為一個供體，并結合一個氧原子；細胞因子受體結合；細胞因子活性；類固醇羥化酶活性；銨離子結合；生長因子受體結合；兒茶酚胺結合；受體配體活性；磷酸酶結合；蛋白酶結合；多巴胺結合；激酶調節活性)，見圖5。

表3 知柏地黃丸成分-性早熟靶點網絡中度值排名前9的靶點

圖5 知柏地黃丸治療性早熟GO功能富集

KEGG通路富集取校正后P<0.05，得到7條通路，為色氨酸代謝信號通路，類固醇激素生物合成信號通路，精氨酸和脯氨酸代謝信號通路，苯丙氨酸代謝信號通路，組氨酸代謝信號通路，酪氨酸代謝信號通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝信號通路，見圖6。

圖6 知柏地黃丸治療性早熟KEGG通路富集

3 討論

CPP的發病是由于HPGA功能提前啟動。一旦HPGA功能啟動，中樞神經系統將解除對下丘腦的抑制，下丘腦發育成熟，并對性激素負反饋調節的敏感性下降，促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌量增加，刺激垂體合成與釋放促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)[10]。FSH可促進男孩睪丸曲細精管中精子的生成，或促進女孩卵巢中卵泡的產生和發育，最終啟動兒童的青春期發育。LH可刺激男孩的睪丸間質細胞合成并分泌睪酮，或觸發女孩排卵，并使排卵后的卵泡壁轉化為黃體和分泌孕酮。目前研究表明，CPP的發病與DLK1基因突變有關，正常的DLK1基因編碼前脂肪細胞因子1(Pref-1)，其主要抑制脂肪細胞分化，把脂肪儲存變為外周脂質氧化。當DLK1基因發生突變，血清中的DLK1蛋白水平降低，可產生1種新的介于生殖系統與代謝之間的抗脂肪代謝途徑，表現為生殖器官發育伴肥胖、糖耐量異常或2型糖尿病、高脂血癥[11]。已知當瘦素達到生殖標準時，會促進青春期的啟動，而瘦素是一種由白色脂肪組織分泌的蛋白質，主要是調節機體能量平衡[12]。因此，一部分肥胖、脂代謝異常的患兒可能會出現性早熟。

中醫認為，性早熟的發病與腎的功能密切相關，其病機為相火旺盛，致陰虛火旺，治療當以滋陰降火為法[13]，首選知柏地黃丸。知柏地黃丸出自《醫宗金鑒》，含有澤瀉、山茱萸、黃柏、熟地黃、牡丹皮、山藥、茯苓、知母8味中藥，其中澤瀉能夠清熱利便、引火下行，山茱萸具有補腎澀精之功效，黃柏具有清熱瀉火等功效，諸藥合用能夠填補腎陰、泄相火。

3.1 有效成分

本研究結果表明，槲皮素、山柰素、β-谷甾醇、脫水淫羊藿素、(S)-氫化小檗堿、豆甾醇等為知柏地黃丸中治療性早熟的主要有效成分。槲皮素、山柰素都屬黃酮類化合物，均為植物雌激素[14-15]。研究表明，槲皮素可抑制卵巢細胞基礎功能(增殖和凋亡、卵巢類固醇和肽激素的釋放)及其上游激素刺激因子FSH的激活反應[14]。山柰素則在人體雌二醇(E2)水平偏高時通過抗E2發揮作用[15]。在肥胖的性早熟患兒中，胰島素抵抗可能干擾肝臟中性激素結合球蛋白的合成，導致E2失活的減少，外周組織會持續存在未對抗的E2[16]。E2水平與子宮、卵巢容積呈正相關，高水平的E2持續作用于骨骺生長板，可促進骨成熟[17]。山柰素還可抑制脂質積累，增加脂肪細胞中脂肪酸氧化信號[18]。β-谷甾醇和豆甾醇都屬植物甾醇。研究表明，雄性大鼠的睪酮和雌性大鼠的E2等性激素水平因攝入β-谷甾醇而升高[19]。而對山羊的研究表明，β-谷甾醇對生殖能力的影響卻相反[20]。另外，β-谷甾醇一方面可增加脂肪細胞對葡萄糖的攝取，并在分化為前脂肪細胞時刺激脂肪生成，一方面還能誘導脂肪細胞的脂解[21]。豆甾醇比β-谷甾醇在減少脂肪生成上更有效[22]。脫水淫藿素是淫羊藿苷的代謝產物，淫羊藿苷屬于黃酮類化合物。脫水淫羊藿素是一種有效的轉錄因子固醇調節元件結合蛋白(SREBPs)抑制劑[23]。已知SREBPs涉及人體游離脂肪酸和膽固醇合成的全過程，在脂代謝的調節過程中有重要的作用[24]。因此，脫水淫藿素可通過抑制SREBPs調節脂質代謝的功能，改善血脂異常和胰島素抵抗。

3.2 作用靶點

通過構建成分-靶點網絡，分析網絡拓撲結構參數，得到的關鍵靶點有前列腺素內源性過氧化物合酶2(PTGS2)、PTGS1、β-2腎上腺素能受體(ADRB2)、孕酮受體(PGR)、雄激素受體(AR)、ESR1、γ-氨基丁酸受體亞單位α-1(GABRA1)、核受體亞家族3C組成員1(NR3C1)等。其中，PGR為孕酮受體，可調節許多下游靶基因的表達。孕酮、E2等類固醇激素通過PGR發揮對靶細胞的作用[25]。PGR也調節卵母細胞從卵泡中成功釋放。研究表明，PGR的表達被抑制時，小鼠排卵率嚴重降低，卵母細胞被截留[26]。此外，孕酮對靶基因轉錄的激活過程需要共調節因子參與其與PGR的結合。其中一種是共激活因子，起增強靶基因轉錄的作用；另一種是共抑制因子，起抑制靶基因轉錄的作用[25]。根據成分-靶點圖，發現PGR為β-谷甾醇、谷甾醇、山柰素等成分的作用靶點。因此，β-谷甾醇、谷甾醇、山柰素等成分可能作為共抑制因子抑制PGR靶基因轉錄。已知，介導E2生理作用的雌激素受體(ER)有2種亞型，分別為ERα和ERβ，分別由ESR1和ESR2基因編碼[27]，與黃體形成過程有關。其中，女性ERα和ERβ主要分布于卵巢及乳房中，子宮中以ERα為主；男性ERα和ERβ主要分布于睪丸中，前列腺中以ERβ為主，ERα同時高表達于下丘腦、終紋床核與生殖調節有關的腦區[28]。性早熟的發病需要ER與相應性激素結合活化而發揮作用，已知槲皮素、山柰素等植物雌激素有拮抗部分性激素的作用。因此，含有此類成分的知柏地黃丸可能通過拮抗E2的分泌，或抑制環境內分泌干擾物(EEDs)對ER的介導作用，從而發揮治療性早熟的作用。另外，AR與PGR、ER同為類固醇激素受體，是配體激活的轉錄因子。雄激素通過和AR的結合調控男性生殖器官的發育及維持正常的性功能，并在女性生殖器官的發育及功能發揮中起重要的作用。若雄激素與AR結合后的信號失調，則可能擾亂正常的生殖系統發育[29]。因此，AR作為性腺受體在治療性早熟中發揮著傳遞信號的作用。結合GO功能富集結果可知，知柏地黃丸通過作用于PGR、ESR1、ESR2、AR等，影響機體的核受體活性、轉錄因子活性、直接配體調控的特異性DNA序列結合、類固醇激素受體活性功能。另外，研究表明，GABRA1在哺乳動物的初情期，其受體會達到峰值，并刺激下丘腦，使GnRH脈沖分泌加強，進一步刺激促性腺激素分泌，最終導致卵泡發育和排卵[30]。因此，GABRA1作為主要靶點可能受到槲皮素、山柰素等植物雌激素負反饋調節作用。

NR3C1為糖皮質激素受體α-D3亞型，NR3C1基因遺傳缺陷可致全身或局部對糖皮質激素不敏感[31]。若血皮質醇(CORT)減少，對HPGA的抑制作用會減弱，則促腎上腺皮質激素(ACTH)代償性分泌增多，促使孕酮及17-羥孕酮堆積并向雄激素合成途徑轉化，致睪酮、雄烯二酚等增多，部分患兒可出現發育早、骨齡超出年齡[32]。且部分性早熟患兒可出現肥胖，隨著肥胖的發展，CORT影響下丘腦的糖皮質激素受體水平上升，因此，糖皮質激素受體是代謝紊亂的中介[33]。研究發現，知柏地黃丸能提高腎上腺皮質激素型腎陰虛大鼠的CORT水平，恢復腎上腺組織形態和細胞正常分泌功能[34]。ADRB2在能量消耗和脂類代謝方面有重要作用，并與肥胖有一定相關性[35]。知柏地黃丸中的小檗堿、豆甾醇等成分有糾正脂代謝異常的作用[22，36]，且作用靶點為ADRB2。綜上所述，知柏地黃丸通過糾正性早熟患兒體內各種代謝功能異常而達到治療作用。

知柏地黃丸節點度值最高的作用靶點為PTGS1和PTGS2。PTGS1和PTGS2是前列腺素(PG)合成所必需的2個催化酶，PG則可刺激垂體前葉分泌LH和FSH[37]。PTGS2還可產生一些分子信號，誘導LH、FSH等與相應受體結合[38]。根據成分-靶點圖，槲皮素、山柰素、β-谷甾醇、脫水淫羊藿素、(S)-氫化小檗堿、豆甾醇等成分均可作用于PTGS1和PTGS2。因此，知柏地黃丸可能通過作用PTGS1和PTGS2拮抗PG，從而影響垂體前葉對LH和FSH的分泌作用、性激素的釋放及其與受體結合等功能。

3.3 PPI網絡

PPI網絡是由單個蛋白之間通過相互作用構成，表示參與生物信號傳遞、基因表達調節、能量和物質代謝及細胞周期調控等生命過程的各個環節，對了解蛋白之間的功能聯系有重要意義。已知Akt1、MAPK14、IL-6、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-2、EGF、FOS等為PPI網絡度值較高的蛋白。在PPI中，Akt1、MAPK14參與磷酸酶結合功能。Akt1為3種密切相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，主要調節代謝、增殖、細胞存活等過程[39]。已知，Akt1參與的磷酸酶結合功能是胰島素樣生長因子1(IGF1)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)介導脂肪細胞分化作用所必需的，IGF1是前脂肪細胞存活、增殖和分化必不可少的介質[40]。而PI3K則是脂肪細胞生物活性特定的信號傳導途徑，抑制PI3K會顯著損害前脂肪細胞的分化[41]。因此，Akt1參與的磷酸酶結合與脂肪代謝相關。MAPK14主要參與調節卵巢細胞功能的活動，包括卵丘卵母細胞(COC)的膨脹和類固醇激素的生成[42]。MAPK也是連接細胞膜表面受體與決定性基因表達之間的重要信號調節酶之一，其蛋白質磷酸化是快速傳遞細胞內信號的重要途徑，也是快速調節細胞對外界反應的基礎[43]。因此，MAPK14通過磷酸酶結合發揮信號通路作用，在細胞因子產生、轉錄調節中起重要作用[44]。IL-6、IL-1β、IL-1、IL-2均為細胞因子，GO富集提示，其主要參與細胞因子活性、生長因子受體結合、受體配體活性功能。其中，IL-6與瘦素在脂質代謝和體質量增加方面具有顯著的功能[45]。IL-1β則可參與骨細胞代謝調節，在一定劑量下，對成骨細胞表型具有顯著拮抗作用[46]。另外，IL-1β和IL-6可協同刺激小鼠顱骨成骨細胞中前列腺素E2(PGE2)，從而促進合成環加氧酶-2(COX-2)和酪氨酸激酶，為鼠成骨細胞中PTGS2表達的有效刺激因子[47]。IL-6、IL-1β與性早熟導致兒童骨齡提前、骨骺融合過早等臨床特征相關[48]。IL-1β還可通過參與蛋白酶合成、PG產生和顆粒細胞類固醇激素生成過程，進而參與機體的排卵，并激活人體顆粒-葉黃素細胞中的細胞外信號調節激酶(ERK)1/2和p38途徑，增加環狀單磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)磷酸化來刺激孕酮的合成[49]。而IL-10則具有抑制炎癥反應和抑制基因轉錄作用[50]，實驗發現，激活骨骼肌中IL-10信號，IL-10可通過糖異生途徑改善慢性高脂飲食的肥胖小鼠的葡萄糖代謝，改善胰島素抵抗[51]。細胞因子IL-2與IL2R結合后，能促進各種亞型淋巴細胞活化。已知PI3K/Akt通路在T細胞活化和生長的合成代謝管理中發揮作用[52]。因此，IL-2受體配體活性功能也參與了PI3K/Akt通路。FOS在骨骼細胞的形成和發育方面起著關鍵作用，其在骨組織中的表達受ADRB2、p38MAPK等多種因素調節[53]。被MAPK磷酸化后可改變其活性與穩定性[54]。在KEGG通路中，FOS與作用靶點MAPK14間存在內分泌阻力、MAPK信號通路等通路。EGF可直接影響卵巢內分泌功能，表現為抑制E2合成分泌，促進孕酮合成代謝，還可促進垂體分泌FSH和LH[55]，還是促卵泡LH信號的關鍵傳遞子，對卵母細胞的發育和成熟至關重要[56]。在PPI中，EGF主要是與Akt1、IGF2通過PIK3/Akt信號通路和MAPK信號通路發生聯系。

3.4 KEGG通路

通過KEGG通路發現，知柏地黃丸的作用靶點主要富集于色氨酸代謝、類固醇激素生物合成等信號通路。已知色氨酸代謝作為細胞和組織溝通的一部分，其代謝的底物在免疫反應和神經傳遞等途徑中發揮作用[57]。而單胺類氧化酶A(MAOA)和單胺類氧化酶B(MAOB)在PPI中參與了色氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝，酪氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝6條通路。普遍認為，單胺氧化酶與神經變性、神經遞質代謝紊亂相關，MAOA為5-羥色胺和腎上腺素的底物，并在腦內分布在腎上腺素能神經元，而MAOB分布在5-羥色胺能神經元和神經膠質細胞[58]。因此，MAOA和MAOB在KEGG通路上參與神經遞質代謝。已知知柏地黃丸治療性早熟的作用可能與抑制HPGA功能提前發動有關，并抑制機體分泌雄激素、E2等類固醇激素參與第二性征發育[59]。在KEGG通路中，參與類固醇激素合成信號通路的有CYP3A4、CYP1A2、CYP1A1及CYP1B1，為細胞色素P450家族，能將性激素等類固醇激素氧化，參與類固醇代謝途徑[60]。而該通路上的醛酮還原酶1C3(AKR1C3)則減少E2、睪酮等類固醇激素和PG，并參與外源性生物轉化，影響增殖信號通路[61]。而參與類固醇合成功能的有PGR、ESR1、ESR2、AR等靶點，為知柏地黃丸主要的作用靶點。因此，考慮知柏地黃丸通過抑制該通路上的信號傳遞以達到治療性早熟的目的。

綜上所述，知柏地黃丸中的槲皮素、山柰素、β-谷甾醇、脫水淫羊藿素、(S)-氫化小檗堿、豆甾醇等主要活性成分作用于PTGS2、PTGS1、ADRB2、PGR、AR、ESR1、GABRA1、NR3C1等靶點和色氨酸代謝、類固醇激素生物合成等信號通路，在分子水平上綜合調控性早熟。