基于HPLC-Q/TOF-MS的經(jīng)典名方苓桂術(shù)甘湯成分快速分析△

閔會，羅婷婷，印曉紅，徐斌，查慧軍，王建方，王如偉*

1.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052；2.浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052

經(jīng)典名方是古方中藥方劑的杰出代表，經(jīng)過幾千年仍應(yīng)用廣泛、療效確切，具有明顯的特色與優(yōu)勢，是中醫(yī)藥事業(yè)的瑰寶。為支持中醫(yī)藥發(fā)展、縮短中藥方劑研發(fā)周期、降低研發(fā)成本，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《關(guān)于印發(fā)中藥注冊管理補(bǔ)充規(guī)定的通知》(以下簡稱《通知》)，《通知》要求“來源于古代經(jīng)典名方的中藥復(fù)方制劑，可僅提供非臨床安全性研究資料，并直接申報生產(chǎn)。” 近年來，經(jīng)典名方的開發(fā)研究成為中醫(yī)藥事業(yè)的熱點(diǎn)之一，經(jīng)典名方的中藥制劑研發(fā)是新時期中藥產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要舉措[1-2]。

苓桂術(shù)甘湯出自東漢張仲景《金匱要略》，其原處方為“茯苓四兩，桂枝(今肉桂)、白術(shù)各三兩，甘草二兩，上四味，以水六升，煮取三升，分溫三服。”主治中陽不足導(dǎo)致的痰飲水濕證[3]。苓桂術(shù)甘湯在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用廣泛，主要用于心血管疾病、梅尼埃綜合征、慢性支氣管炎、盆腔炎和眼科疾病等[4]。苓桂術(shù)甘湯是中醫(yī)“異病同治”思想的典型代表方之一，在健脾、利水、化痰方面有著顯著效果，且不良反應(yīng)較小，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值，收錄于《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》[5-6]。

目前，對于苓桂術(shù)甘湯的研究文獻(xiàn)主要集中于藥理作用及臨床應(yīng)用方面，缺乏對其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。為快速高效分析苓桂術(shù)甘湯中化學(xué)物質(zhì)成分，本研究首次采用高效液相色譜-四級桿/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-Q/TOF-MS)技術(shù)建立快速分析方法，對苓桂術(shù)甘湯提取物進(jìn)行快速分析鑒定，明確其物質(zhì)基礎(chǔ)，為其質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 6530型HPLC-Q/TOF-MS高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Milli-QA10型純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥

乙腈(Merck，色譜純)；甲酸(Aladdin，色譜純)；超純水(自制)。

茯苓飲片(批號：190226)、肉桂飲片(批號：190215)、白術(shù)飲片(批號：190312)、甘草飲片(批號：190214)均購自杭州華東中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1苓桂術(shù)甘湯提取物制備 取茯苓12 g、肉桂9 g、白術(shù)9 g、甘草6 g，加水1.2 L，煎煮至0.6 L，趁熱濾過，減壓濃縮至200 mL，置真空冷凍干燥器中干燥，得苓桂術(shù)甘湯提取物。

2.1.2供試品制備 取苓桂術(shù)甘湯提取物0.2 g，加水溶解，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，注入進(jìn)樣小瓶，即得。

分別取各味中藥粉末，茯苓1.2 g、肉桂0.9 g、白術(shù)0.9 g、甘草0.6 g，各加水120 mL，加熱回流1 h，放冷，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，注入進(jìn)樣小瓶，即得。

2.1.3色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相B，0.1%甲酸水溶液為流動相A進(jìn)行梯度洗脫(0～10 min，5%～20%B；10～15 min，20%～23%B；15～30 min，23%～32%B；30～40 min，32%B；40～50 min，32%～38%B；50～60 min，38%～48%B；60～70 min，48%～65%B；70～75 min，65%～95%B；75～85 min，95%B)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.4質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)正、負(fù)離子，Auto MS/MS模式；離子掃描范圍m/z50～1000，采集時間85 min；干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速8 L·min-1，霧化氣壓力241 316.6 Pa，毛細(xì)管電壓3500 V，裂解電壓175 V，錐孔電壓65 V，碰撞能30 V。

2.2 結(jié)果

按照上述條件對苓桂術(shù)甘湯提取物及各味藥材飲片進(jìn)行分析，得到苓桂術(shù)甘湯全方的總離子流(TIC)圖，見圖1。為了獲得盡可能多的信息，本研究采用正、負(fù)2種離子全掃模式對其成分進(jìn)行定性分析。

注：A.正離子模式；B.負(fù)離子模式。

根據(jù)一級質(zhì)譜精確m/z找到化合物的準(zhǔn)分子離子，再通過二級質(zhì)譜圖得到化合物的碎片離子信息，利用PubChem、HMDB、MassBank等數(shù)據(jù)庫，根據(jù)不同種類化合物的化學(xué)鍵斷裂規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)信息，對譜圖中的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定，共得到苓桂術(shù)甘湯中60個化合物。其中，來源于甘草43個、肉桂2個、茯苓3個、白術(shù)7個，2味或2味以上共有的化學(xué)成分5個，主要分為有機(jī)酸、黃酮、三萜皂苷、三萜酸、內(nèi)酯等類成分，化合物具體鑒定結(jié)果見表1。

表1 苓桂術(shù)甘湯物質(zhì)基礎(chǔ)解析結(jié)果

2.2.1有機(jī)酸類 有機(jī)酸廣泛存在于各類中藥中，其藥理作用主要表現(xiàn)在抗炎、抗氧化等方面[7]。本研究共鑒定出5種有機(jī)酸類成分，主要?dú)w屬于白術(shù)、甘草和肉桂。峰8、11、12在負(fù)模式下準(zhǔn)分子離子均為m/z353.090 2[M-H]-，分子式為C16H18O9，在二級質(zhì)譜圖中均能見m/z191特征碎片，是由母離子失去1分子咖啡酰基所得[M-C6H10O5-H]-，根據(jù)極性及出峰順序，結(jié)合參考文獻(xiàn)[8]鑒定峰8、11、12分別為新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸。峰35的準(zhǔn)分子離子為m/z147.044 6[M-H]-，分子式為C9H8O2，在二級質(zhì)譜圖中可見m/z129，103碎片，結(jié)合參考文獻(xiàn)[9]鑒定為肉桂酸。

以綠原酸(化合物11)為例，如圖2所示，說明其裂解規(guī)律，其中m/z353.090 2為綠原酸的準(zhǔn)分子離子峰m/z[M-H]-，裂解產(chǎn)生二級碎片離子為m/z191。

圖2 ESI-模式下的綠原酸二級質(zhì)譜圖

2.2.2黃酮類 黃酮類化合物被認(rèn)定為中藥重要的藥效物質(zhì)成分，廣泛存在于植物中。目前，已有上萬個黃酮類成分被發(fā)現(xiàn)，其具有多樣的生理活性，臨床上常用于治療癌癥、腫瘤、心腦血管疾病及調(diào)節(jié)免疫等[10]。黃酮類化合物具有基本的C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，天然黃酮類化合物多與糖基結(jié)合，以黃酮苷的形式存在。因此，在二級質(zhì)譜響應(yīng)中，多呈現(xiàn)較高的黃酮苷元信號。本研究共鑒定17個黃酮類化合物，全部歸屬于甘草。如峰19，在負(fù)離子模式下其準(zhǔn)分子離子為m/z417.120 4[M-H]-，分子式為C21H22O9，在二級質(zhì)譜圖中見明顯m/z255的黃酮苷元信號，為準(zhǔn)分子離子失去1β-D-葡萄糖基所得[M-C6H11O5-H]-，結(jié)合參考文獻(xiàn)[9]鑒定為甘草苷。峰23在負(fù)模式下準(zhǔn)分子離子為m/z459.132 2[M-H]-，分子式為C23H24O10，在二級質(zhì)譜圖中可見明顯的m/z255黃酮苷元信號，為母離子失去1糖基所得[M-C8H13O6-H]-，結(jié)合參考文獻(xiàn)[9]鑒定為6″-O-乙酰甘草苷。

以甘草苷(化合物19)為例，如圖3所示，說明其斷裂規(guī)律，其中m/z417.120 4為甘草苷的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，裂解產(chǎn)生二級碎片離子為m/z255。

圖3 ESI-模式下的甘草苷二級質(zhì)譜圖

2.2.3三萜類 萜類化合物是自然界種類最多、分布最廣泛的一類天然產(chǎn)物，以異戊二烯作為結(jié)構(gòu)單元，通式為(C5H8)n。三萜類化合物多數(shù)含有6個異戊二烯單元，多為四環(huán)三萜或五環(huán)三萜，有游離存在于植物體中的，也有與糖結(jié)合成三萜皂苷的。本研究共鑒定出24個三萜類成分，其中包括3個歸屬于茯苓的三萜酸類和21個甘草中的三萜皂苷類。峰59在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z483.313 9[M-H]-，分子式為C30H44O5，在二級質(zhì)譜圖中明顯找到m/z409，325，73的碎片離子，m/z409為母離子失去1-CH3CH2COOH基所得[M-CH3CH2COO-H]-，子離子繼續(xù)失去1分子CO2得到m/z367碎片，其斷裂規(guī)律符合三萜酸類裂解規(guī)律[11]，因此，鑒定化合物59為茯苓新酸B。同樣的規(guī)律鑒定化合物60為茯苓新酸A，化合物54為16α，25-二羥基去氫齒孔酮酸(16α，25-dihydroxydehydroeburiconic acid)。

鑒定出歸屬于甘草的三萜皂苷類成分共21個，其與苷元結(jié)合的糖基易斷裂，因此，在二級質(zhì)譜響應(yīng)中都呈現(xiàn)出強(qiáng)苷元信號。如峰36在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z839.405 3[M+H]+，分子式為C42H62O17，在二級質(zhì)譜圖中得到m/z487，469，451碎片離子，m/z469為母離子失去2個β-D-吡喃葡萄醛酸基所得[M-C12H18O13+H]+，再脫去1分子H2O得到m/z451[M-C12H18O13-H2O+H]+，結(jié)合參考文獻(xiàn)[12]鑒定化合物36為甘草皂苷G2。

以茯苓新酸B(化合物59)為例，如圖4A所示，說明三萜酸類裂解規(guī)律，其中m/z483.313 9為茯苓新酸B的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，裂解產(chǎn)生二級碎片離子為m/z409和73。以甘草皂苷G2(化合物36)為例，如圖4B所示，說明三萜皂苷類裂解規(guī)律，其中m/z839.405 3為甘草皂苷G2的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，裂解產(chǎn)生二級碎片離子為m/z487，469和451。

注：A.ESI-模式下的茯苓新酸B；B.ESI+模式下的甘草皂苷G2。

2.2.4內(nèi)酯類 本研究共鑒定出內(nèi)酯類成分5個，其中包括白術(shù)內(nèi)酯類4個和肉桂中的香豆素1個。峰58在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z233.153 3[M+H]+，分子式為C15H20O2，在二級質(zhì)譜圖中得到碎片m/z187，131和105。其中，m/z187為母離子失去1-CH2O2得到[M-CH2O2+H]+，m/z131為子離子內(nèi)部發(fā)生重排反應(yīng)，失去1-C4H8所得[M-CH2O2-C4H8+H]+，進(jìn)一步失去1-C2H2得到m/z105碎片，結(jié)合參考文獻(xiàn)[13]鑒定為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。香豆素屬于苯丙素類化合物，天然苯丙素類化合物具有C6-C3結(jié)構(gòu)，因其也具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，二級質(zhì)譜中裂解規(guī)律和白術(shù)內(nèi)酯類似。峰27在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為m/z147.044 0[M+H]+，其分子式為C9H6O2，在二級質(zhì)譜圖中得到碎片m/z103，為母離子失去1-CH2O2所得[M-CH2O2+H]+，結(jié)合參考文獻(xiàn)[14]鑒定為香豆素。

以白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(化合物58)為例，如圖5A所示，說明其裂解規(guī)律，其中m/z233.153 3為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，裂解產(chǎn)生二級碎片離子為m/z187，131和105。圖5B為香豆素(化合物27)的裂解規(guī)律，其中m/z147.044 0為香豆素的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，裂解產(chǎn)生二級碎片離子為m/z103和91。

注：A.ESI+模式下的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；B.ESI+模式下香豆素。

除了以上類別的化合物外，本研究還得到少數(shù)氨基酸、核苷酸、糖苷類化合物。

3 討論

中藥具有成本低、療效好、不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)，因其多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)對于慢性疾病的治療具有顯著優(yōu)勢。隨著系統(tǒng)生物學(xué)、信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展，針對復(fù)雜性疾病的多靶點(diǎn)創(chuàng)新藥研發(fā)是未來藥物研發(fā)的重要途徑。經(jīng)典名方在幾千年的歷史中發(fā)揮著重要的臨床價值，在中藥新藥研發(fā)中意義重大[15-16]。但也因其化學(xué)物質(zhì)復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)難以明確，有效性研究證據(jù)不足致使研發(fā)困難重重。HPLC-Q/TOF-MS具有高分辨率、高靈敏度的特點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)化合物復(fù)雜體系的快速分析。本研究為全面表征苓桂術(shù)甘湯的物質(zhì)基礎(chǔ)成分，基于HPLC-Q/TOF-MS技術(shù)，對液相流速、柱溫、毛細(xì)管電壓、碰撞能等多個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了苓桂術(shù)甘湯成分快速分析的方法；再通過一級質(zhì)譜圖找到化合物的準(zhǔn)分子離子，然后再根據(jù)二級碎片信息，結(jié)合文獻(xiàn)分析各類化合物的裂解規(guī)律，最終共鑒定60個化合物。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，為苓桂術(shù)甘湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制等研究提供參考。但高分辨質(zhì)譜技術(shù)仍然存在一定局限性，無法區(qū)分同分異構(gòu)體，因此，通過該技術(shù)鑒定同分異構(gòu)體比較困難。

本研究所鑒定的60個化合物，其中來源于甘草的42個、肉桂的2個、茯苓的3個、白術(shù)的7個，2味或2味以上共有的化學(xué)成分5個。因古代經(jīng)典名方均為水煎煮提取，而茯苓中的三萜類成分和水不溶性多糖類成分難用水溶出，本方法完全還原古方，因此，在苓桂術(shù)甘湯提取物中檢測到的茯苓特征成分較少。肉桂、白術(shù)中含有較多揮發(fā)油類成分，揮發(fā)油在煎煮過程中受火候、煎煮時間等影響，存在不同程度的損失，因此，肉桂和白術(shù)的特征成分也較少。本研究的意義在于提供一種快速分析方法，表征苓桂術(shù)甘湯的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為其質(zhì)量控制提供參考，考慮到實(shí)際煎煮過程對揮發(fā)性成分的影響難以控制，因此，未專門針對揮發(fā)性成分進(jìn)行補(bǔ)充研究。不同的煎煮工藝會影響各成分的溶出，因此，不同煎煮工藝下苓桂術(shù)甘湯的物質(zhì)基礎(chǔ)可能會存在差異，后期也會持續(xù)研究與關(guān)注。