基于生物信息學方法分析心肌梗死大鼠miRNA芯片

姚道敏,謝 亮,宮劍濱,朱 靜,劉 晶

(1．南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2．南京大學醫學院附屬金陵醫院心臟內科，江蘇 南京 210000)

心肌梗死是導致心臟重塑和慢性心衰發生的常見不良心血管事件，發病率和致死率居高不下，患者病理性心肌改變的分子機制仍未得到充分闡釋[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為非編碼RNA的一種，長度在20個核苷酸左右，廣泛存在于機體的各個組織細胞內，在基因的表達調控中具有重要的作用[2]。miRNA通常與信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3′非翻譯區( 3′untranslated region，3′UTRs)或編碼序列(coding sequence,CDS)區結合抑制翻譯或誘導mRNA降解。miRNA與靶基因的5′非翻譯區(5′untranslated regions，5′UTRs)結合能激活轉錄[3]。有關MicroRNA在心肌梗死發生發展中的研究日益增多。MiR-15、miR-195、miR-122 、miR-181a等miRNA在心肌梗死后表達增加，而MiR-24、miR-138、miR-214、miR-499等miRNA在心肌梗死后表達減少。實驗表明根據這一變化規律，相應得使miRNA過表達或抑制能有效改善心肌梗死的癥狀。特殊的是，MiR-320在心肌梗死后表達減少，過表達MiR-320不能減輕心肌梗死的癥狀反而促進心肌凋亡和壞死的發生。產生這一現象的原因是MiR-320抑制的靶基因對心臟具有保護作用[2]。MiRNA在心肌梗死中的作用復雜，本研究以microarray芯片結果為切入點，尋找心肌梗死中新的LncRNA-miRNA-mRNA三元關系。

1 材料與方法

1.1 大鼠心肌梗死模型的制備8-10周齡雄性清潔級SD大鼠(275±25) g,6只，由南京大學醫學院附屬金陵醫院提供，實驗動物使用許可證號為SCXK(軍)2012-0014。隨機分為2組(n=6):心肌梗死(MI)組和假手術(sham)組。以50 mg·kg-1的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉(產品批號：11751，Sigma Aldrich，USA)麻醉大鼠并將其固定在無菌手術臺上。心電圖機(CardiMax FX-7202，錫爾摩電氣有限公司，中國)電極連接在四肢皮下，記錄標準導聯心電圖。氣管插管并連接呼吸機(HX-100E小動物呼吸機，成都市泰盟軟件有限公司，中國)，控制潮氣量在3 mL·kg-1，呼吸比2 ∶1，呼吸頻率60-70次/min。縱行切開心臟最強波動處的皮膚約4 cm，鈍性分離，于第3或4肋間開胸，將心臟暴露。用6-0線在左心耳根部下方3-5 mm處連同少量心肌組織縫扎左冠狀動脈前降支。當缺血區心肌變蒼白，運動減弱，心電圖I、avL導聯ST段弓背向上抬高0.1 mV持續30 min表明結扎成功。逐層關胸，置于37 ℃恒溫下使大鼠蘇醒。假手術組進行相同的操作，但不結扎冠狀動脈。術后4 h再次麻醉大鼠，快速開胸取心臟，用眼科剪(南京大學附屬金陵醫院普外科)小心沿左室剪下梗死心肌組織，立即置于液氮中冷凍，然后置于干冰中送樣。

1.2 miRNA芯片由上海康成生物技術有限公司完成大鼠梗死心肌組織樣品分析和miRNA芯片雜交。簡要地說，用TRIzol試劑(Invitrogen)提取缺血心肌細胞中的RNA，純化后用nanodropND-1000分光光度計(美國，賽默)，測量RNA濃度，并通過凝膠電泳確定RNA完整性。接下來使用miRCURYTMHy3TM/Hy5TM功率標記試劑盒標記樣品，并在miRCURYTMLNA陣列(v.18.0)上雜交。在洗滌步驟之后，使用Agilent Microarray Scanner 和Agilent Feature Extraction軟件進行miRNA陣列掃描，并進行標準化處理。

1.3 lncRNA芯片由上海康成生物技術有限公司完成大鼠梗死心肌組織樣品分析和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)芯片雜交。簡言之，在去除核糖體RNA(Ribosomal RNA，rRNA)后，從總RNA中純化mRNA(mRNA-ONLYTM真核mRNA分離試劑盒，Epicentre)。然后，使用Quick Amp Labeling Kit將每個樣品擴增并沿著轉錄物的全長轉錄為熒光cRNA。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)純化標記的互補RNA(complementary RNA，cRNA)。標記的cRNA的濃度和比活性通過NanoDrop ND-1000測量。加入5 μL 10×封閉劑和1 μL 25×Fragmentation Buffer裂解1 μg每個標記的cRNA，然后將混合物在60 ℃加熱30 min，最后加入25 μL 2×GE雜交緩沖液稀釋標記的cRNA。將50 μL的雜交溶液分配到墊片載玻片中，并組裝到LncRNA表達微陣列載玻片上。將載玻片在安捷倫雜交爐中于65 ℃孵育17 h。洗滌固定雜交陣列，使用Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)進行掃描，用Agilent Feature Extraction軟件進行數據處理。

1.4 mRNA芯片由上海康成生物技術有限公司完成大鼠梗死心肌組織樣品分析和mRNA芯片雜交。根據制造商的說明，使用TRIzol(Invitrogen)和RNeasy試劑盒(Qiagen)，從大鼠心肌組織中提取總RNA，包括DNase消化步驟，并完成RNA質量評估。使用安Quick Amp Labeling Kit對樣品進行擴增和標記。然后將標記的探針與全大鼠基因組寡核苷酸微陣列試劑盒(包括41 000個大鼠基因和轉錄本；安捷倫)在65 ℃雜交緩沖液中雜交。過17 h，在室溫下，先用0.5×SSC/0.01% SDS洗滌5 min，再用0.06×SSC洗滌2 min。用安捷倫DNA微陣列掃描儀掃描標記物強度，用Agilent Feature Extraction Software(版本10.5.1.1)提取數據結果，用安捷倫GeneSpring GX軟件(版本10.0)進行進一步分析。使用Agilent FE單色方案在GeneSpring GX中對微陣列數據集進行歸一化處理。中對微陣列數據集進行歸一化處理。

1.5 差異表達的miRNA分析使用MEV軟件(v4.9)進行差異表達的miRNA的系統聚類，以顯示可區分的基因。根據基因之間的距離將基因分組在一起。系統聚類的默認距離度量是皮爾遜相關性，選擇的鏈接方法是平均鏈接聚類。采用在線網絡工具Ehbio(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制差異表達的miRNA的火山圖。

1.6 lncRNA-miRNA相互作用預測對篩選出來的差異表達的lncRNA和mRNA進行Pearson相關分析，并計算Pearson相關系數(PCC)。LncTar是一款通過自由能(ndG)最小化預測lncRNA-RNA相互作用的在線網絡工具(http://www.cuilab.cn/lnctar)。ndG被認為是確定配對的RNA是否相互作用的臨界值，一般設為-0.1。可以用于預測各種類型的RNA分子(mRNA，lncRNA，miRNA)和其他類型的非編碼RNA之間的相互作用。

1.7 miRNA靶基因預測及功能分析miRNA靶基因預測使用miRWalk3.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)進行，該軟件集成了mirTarBaseV7.0，TargetScanV7.1和miRDBV5.0的預測結果。Bindingp≥0.95被認為是作為miRWalk中預測分析的臨界標準。將預測的上調的miRNA靶基因與mRNA芯片中下調的mRNA取交集，同時將預測的下調的miRNA的靶基因與mRNA芯片中上調的mRNA取交集，用KOBAS在線工具(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)對這兩組交集基因進行GO和KEGG Pathway分析。GO分析的結果顯示了基因的細胞定位，生物學過程和分子功能。KEGG分析結果用于確定基因參與的重要途徑。P<0.05的標準用作定義目標基因及其相關功能和途徑之間存在明顯相關性的閾值。

1.8 lncRNA-miRNA-mRNA網絡構建綜合lncRNA-miRNA相互作用和miRNA靶基因預測及功能分析結果，采用Cytoscape軟件(3.72版)進行lncRNA-miRNA-mRNA網絡整合。

1.9 統計學處理使用2-ΔCt方法將lncRNA，mRNA，miRNA的相對表達水平表示為倍數變化。Fisher的精確檢驗用于GO分析和pathway分析。

2 結果

2.1 miRNA芯片結果分析按Foldchange≥1.5，P≤0.05的標準進行篩選，508個miRNAs結果中，與對照組相比，大鼠心肌梗死組織miRNA芯片結果中，13個miRNAs明顯上調(miR-132-3p、miR-146b-5p、miR-18a-5p、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-222-5p、miR-223-3p、miR-328b-3p、miR-365-5p、miR-449a-5p、miR-490-5p、miR-6333、miR-877)，6個miRNAs明顯下調(miR-122-3p、miR-146a-3p、miR-181b-1-3p、miR-30c-1-3p、miR-3591、miR-3596c)。如Fig 1A所示，明顯上調表達的13個miRNAs位于火山圖中右側，而明顯下調表達的6個miRNAs則位于左側。系統聚類圖(Fig 1B)中可見差異表達的miRNAs的變化情況。

Fig 1 Volcano plot ( A) and hierarchical clustering ( B) of differentially expressed miRNAs

2.2 lncRNA芯片結果分析按照Foldchange≥2，P≤0.05的標準進行篩選，在心肌梗死組織和正常組織之間有75個lncRNAs明顯差異表達，其中30個lncRNAs上調和45個lncRNAs下調。數據庫中已經存在的lncRNAs有14個，其中10個lncRNAs (NR_133672、ENSRNOT00000057772、ENSRNOT00000050986、ENSRNOT00000058957、ENSRNOT00000002846、ENSRNOT00000027501、ENSRNOT00000071997、ENSRNOT00000075631、NR_126574)下調，4個lncRNAs(ENSRNOT00000076118、NR_132625、ENSRNOT00000076620、ENSRNOT000000 48374)上調。

2.3 mRNA芯片結果分析按照Fold change≥2，P≤0.05的標準進行篩選，心肌梗死組與對照組相比，差異表達的mRNAs共有331個，其中189個mRNAs明顯上調，142個mRNAs明顯下調。

2.4 lncRNA-miRNA相互作用結果分析采用LncTar對19個差異表達的miRNAs(Tab 1)和篩選的14個數據庫中已經存在的差異表達的lncRNAs(Tab 2)進行相互作用預測，發現它們之間都有相互結合的作用位點，這一結果印證了miRNA在體內具有廣泛的作用靶點。對差異表達的lncRNA和差異表達的miRNA進行Pearson相關系數計算，Pearson相關系數絕對值≥0.95的lncRNA和miRNA之間可能存在著正向或負向調控的作用。為進一步尋找潛在的lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡，這里僅匯總Pearson相關系數≤-0.95的lncRNA-miRNA的結果，見Tab 3。

Tab 1 Differentially expressed miRNAs

Tab 2 Differentially expressed lncRNAs

Tab 3 Analysis of interaction between LncRNAs and mRNAs

2.5 miRNA靶基因預測及功能富集分析按照P≤0.05，Foldchange≥1.5的標準篩選mRNA芯片中的差異mRNA(附Tab 1),與差異表達的miRNA預測的靶基因取交集的結果如韋恩圖(Fig 2)所示，交集基因見Tab 4。GO和KEGG Pathway分析結果(Fig 3)表明miRNA的靶基因主要定位在細胞質和細胞器，富集在Hippo 信號通路，HIF-1信號通路，FoxO信號通路，小分子代謝過程，輔酶生物合成過程，輔因子的生物合成，脫甲基酶活性等條目中。從眾多GO和KEGG pathway條目中挑選出的凋亡相關基因有Rnf7、I118、Sort1、Igf1、Tgfb2、Serpine1、Tyrobp、Lrp1、Sqstm1、Sema5a、Atp7a、Deptor、Ace、Tsc22d1、Stat3；自噬相關基因有Stat3、Deptor、Sqstm1；線粒體相關基因有Coq5、Qrsl1、Rnf7、Acsl1、Igf1、Stat3、Acsl4、Sqstm1、Ywhaz、Tmem65、Atp7a。這些基因與miRNA的對應關系如Tab 5所示。

Tab 4 Genes in intersection of Venn diagram

Tab 5 Correspondence between apoptotic,autophagy, mitochondrial related genes and miRNAs

Fig 2 Intersection of down-regulated mRNAs with predicted target genes of up-regulated miRNAs(A) and intersection of up-regulated mRNAs and down-regulated miRNAs predicted target genes(B)

2.6 lncRNA-miRNA-mRNA網絡構建結果綜合miRNA與靶基因的對應關系，miRNA與lncRNA相互作用結果，以及凋亡，自噬或線粒體相關基因，找出多條lncRNA-miRNA-mRNA三元關系。調控網絡如Fig 4所示。LncRNA ENSRNOT00000076620的下調可能引起miR-146b-5p的上調，從而抑制Stat3，Sh3pxd2b、Tmem167a、Nop16、Sele、Rnf7、Qrsl1相關基因的表達。lncRNAENSRNOT00000057772的上調可能引起miR-181b-1-3p的下調，從而使對Tnpo1、Sdc4、Pcsk5基因的抑制作用減弱。LncRNA ENSRNOT00000071991的上調可能引起miR-122-3p的下調，從而使對Cdkn1a、Rfx3、RGD1559622、Atp7a、Ckap4、Deptor、Cdc42ep4、St3gal1基因的抑制作用減弱。LncRNA ENSRNOT00000075631的上調可能引起miR-146a-3p、miR-3591的下調，從而使對Rfx3、St3gal1、Slc6a6、Sdc4、Mboat1、Rcn1、Agfg1、Sh3pxd2b、Ace、Adamts1、Add2、Adamts12、Ddx21、Nolc1、Uchl1、Ankar、Mboat1基因的抑制作用減弱。

Fig 3 KEGG analysis of intersection genes of down-regulated mRNAs and predicted target genes of up-regulated miRNAs(A); KEGG analysis of intersection genes of up-regulated mRNAs and predicted target genes of down-regulated miRNAs(B); GO analysis of intersection genes of down-regulated mRNAs and predicted target genes of up-regulated miRNAs(C); GO analysis of intersection genes of up-regulated mRNAs and predicted target genes of down-regulated miRNAs(D)

Fig 4 LncRNA-miRNA-mRNA ternary relationshipRed ovals represent down-regulated miRNAs,Yellow oval represents up-regulated miRNAs.Blue triangles represent target genes.Purple triangles represent apoptotic and autophagy as well as mitochondrial-related genes.Green arrows represent up-regulated lncRNAs.Orange arrows represent down-regulated lncRNAs.

3 討論

心肌梗死是臨床常見病和多發病，嚴重威脅人類健康。研究發現，miRNA 通過調節心肌細胞凋亡、新生血管形成及纖維化等表型發揮功能[2]。LncRNA-Xist 5'發揮海綿作用，通過調節miR-29b-1-5p對靶標Bcl2l2的作用，調節心肌細胞凋亡[4]。LncRNA- APF靶向miR-188-3p，后者導致ATG7上調，從而促進心肌缺血/再灌注損傷中的心肌細胞自噬[5]。

本研究成功制備了心肌梗死模型，共獲得19個明顯差異表達的miRNAs。其中一些已通過大鼠心梗模型實驗得到驗證。它們是miR-21、miR-132、miR-222、miR-223-3p、miR-146a/b、miR-181b、miR-449a-5p、miR-122。臨床試驗表明miR-328、miR-18a是治療心肌梗死的潛在候選分子。目前沒有相關報道表明miR-365-5p、miR-490-5p、miR-6333、miR-30c-1-3p、miR-3591、miR-3596c、miR-877與心肌梗死相關。有文獻表明miR-3596c、miR-877經qPCR驗證在內毒素血癥大鼠心肌組織中差異表達[6]。它們可能成為新的心肌梗死分子標志物，且其功能有待進一步研究。

MiR-132能夠抑制心肌細胞凋亡，改善心肌重塑，減少大鼠心肌梗死面積。miR-132上調，導致白細胞介素1β下調，Bax和Cleaved caspase-3的表達水平降低，左心室射血分數、最大心率增加，左心室壓力降低[7]。LncRNA-Ang362與鄰近基因(miR-221和miR-222)共同發揮調控功能。這兩個miRNA在響應血管緊張素II時過表達，并與LncRNA-Ang362共轉錄以調節大鼠血管平滑肌細胞的增殖[8]。miR-146b與miR-146a在3′末端有兩個不同的核苷酸，具有相似的生物學功能。miR-146a/b通過直接結合IRAK-1、TRAF6和MyD88，抑制核因子κB途徑的激活，減少缺氧誘導的大鼠心肌細胞凋亡。另外，miR-146a/b還靶向內皮生長因子受體，這可能會增加缺氧引起的大鼠心肌細胞損傷。核糖核酸酶L是miR-146b的直接靶標，抑制miR-146b可促進激活核因子κB和具有心臟保護作用的信號轉導與轉錄激活因子Stat3，miR-146b過表達保護心肌細胞免受缺氧誘導的細胞凋亡[9]。過表達的miR-223直接結合RASA1,促進MEK1/2、ERK1/2和AKT的磷酸化，防止大鼠心肌梗死后心臟功能惡化和心肌纖維化[10]。同時過表達miR-223能沉默PARP-1，激活Akt/mTOR途徑，減輕大鼠心肌細胞因缺氧誘導的細胞凋亡和過度自噬[11]。PDCD4是一種促凋亡蛋白，miR-21靶向PDCD4基因調控心肌細胞凋亡，過表達心肌miR-21基因能夠改善心臟功能[12]。miR-181b-5P通過與AKT3和PIK3R3的3'UTRs直接結合，調節大鼠缺血心肌的細胞凋亡和組織損傷的發生發展[13]。lncRNA-MIAT作為競爭性內源RNA通過使miR-181b海綿化而增加STAT3的表達促進增殖并阻止凋亡[14]。lncRNA-XIST通過結合靶向Notch1基因的miR-449調控大鼠心肌細胞凋亡[15]。miR-122-5p的下調可以造成Bax、caspase-3和Bcl-2表達水平的上調，誘導大鼠心肌細胞抗凋亡。目前miR-122-3p的作用還不清楚[16]。臨床研究表明miR-328和miR-18a在心肌梗死發生時，對心肌細胞具有保護作用[17-18]。

為進一步研究 miRNAs 的上下游作用靶點以及它們在心肌缺血缺氧狀態下的作用機制，我們結合篩選出的差異lncRNA和miRNA靶基因預測及功能分析結果，找到了一些可能存在的lncRNA-miRNA-mRNA三元調控網絡。在心肌梗死發生時，有可能存在如下作用機制:(1) LncRNA ENSRNOT00000076620/NR_132625的下調導致miR-146b-5p的上調，上調的miR-146b-5p通過下調STAT3，Rnf7激活心肌細胞凋亡，或通過下調Qrsl1引起心肌細胞線粒體功能障礙，加劇心肌梗死相關癥狀。(2) LncRNA ENSRNOT00000071991的上調引起miR-122-3p、miR-122-5P及其前體miR-122的下調，下調的miR-122通過上調Deptor(mTOR抑制劑)，抑制大鼠心肌細胞自噬的發生，加劇心肌細胞的凋亡過程。(3) LncRNA NR_132625的下調導致miR-21-3P，miR-18a-5p的上調，線粒體相關基因Coq5、Acsl1、Tmem65表達因此降低，心肌細胞線粒體受損，心肌梗死癥狀加重。