響應(yīng)面法優(yōu)化歐李果汁與牛奶復(fù)合益生菌飲料發(fā)酵工藝

陳佳佶，成婧荷，崔清宇，郭嫦娥，王占軍，李衛(wèi)東*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 102488；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 荒漠化治理研究所，寧夏 銀川 750002）

益生菌是生長于人體腸道及生殖系統(tǒng)內(nèi)，有助于維持人體健康以及改善人體微生態(tài)平衡的一類微生物[1]。近年來，益生菌對人類健康的作用受到日益關(guān)注，有關(guān)其生理活性以及營養(yǎng)功能的深入探究也被研究者們提上了日程。研究表明，益生菌對人類健康的作用主要包括緩解腹瀉與乳糖不耐癥、維持腸道菌群平衡、增強免疫力和降血脂等[2-5]。

水果作為一種重要的膳食，被認為是益生菌的理想載體，其不僅含有益生菌生長的必需營養(yǎng)素，且極具風(fēng)味[6]。目前廣泛用于水果發(fā)酵的益生菌主要包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acido-philus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、保加利亞乳桿菌（Lacto bacillus bulgaricus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等[7]。高玉榮等[8]用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）作為發(fā)酵菌株，通過單因素和正交試驗對葡萄汁發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對活菌數(shù)和感官評分影響顯著。郗恩光等[9]利用響應(yīng)面法對香蕉金針菇飲料的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果表明香蕉∶金針菇汁為4∶1（V/V），發(fā)酵劑接種量為4%，蔗糖添加量為5.5%時，感官評分和乳酸含量較高。劉秋豆等[10]對用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）和嗜熱鏈球菌（Lactobacillus acidophilus）發(fā)酵的芒果益生菌飲料進行成分檢測，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)、總糖、維生素C、水分、可溶性膳食纖維和總酚含量增加，還原糖含量顯著減少，說明發(fā)酵果汁的營養(yǎng)價值更高。另外，研究者對其他的一些果蔬原料也進行了益生菌發(fā)酵研究，如火龍果皮[11]、梨[12]和紅樹莓[13]等。

歐李（Cerasus humilis（Bge.）Sok.）為薔薇科（Rosaceae）櫻屬（Cerasus）多年生小灌木[14]。歐李植株根系強大，根冠比為9∶1，具有抗寒、耐旱、耐貧瘠、適應(yīng)性強等特性，是改良土壤、治理荒漠化及防止水土流失的珍稀樹種[15-16]。其核果成熟后近球形，顏色鮮艷豐富，氣味清香宜人[17-18]，富含多種維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和多酚，其中鈣含量居水果榜首，又被譽為“鈣果”，具有非常高的綜合開發(fā)價值[19-22]。但歐李糖酸比較高，不耐儲藏和運輸，成為了歐李產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前歐李開發(fā)的產(chǎn)品主要有果脯、果醬、凍干果、果汁、果酒等，關(guān)于歐李復(fù)合益生菌飲料工藝尚鮮見報道。本研究以歐李和牛奶為主要原料，采用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）及青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）等益生菌進行發(fā)酵，制備復(fù)合益生菌飲料，并通過單因素試驗考察和響應(yīng)面試驗設(shè)計對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，旨在為歐李的綜合開發(fā)利用提供新途徑，也為國內(nèi)益生菌飲料提供新產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

京歐2號歐李：采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)正藍旗（五一牧場二分廠，北緯N42°21′53.77″東經(jīng)E116°11′57.93″）。歐李近成熟期（水果硬度大于85%）采收后迅速冷鏈轉(zhuǎn)運到實驗室，經(jīng)水洗和去雜質(zhì)后，分裝，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆?；脫脂奶粉：?nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司；白砂糖（食品級）：南京甘汁園糖業(yè)有限公司。

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum，LP）BNCC 185342、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LA）BNCC 185342、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis，BA）：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

果膠酶（40 U/mg）：北京酷來博科技有限公司；酵母提取物：廣東一品鮮生物科技有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JE2600家用榨汁機：北京中興柏翠電器有限公司；BAS 124S電子天平：德國賽多利斯股份公司；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；BY-G20型高速離心機：北京白洋醫(yī)療器械有限公司；LH-T32手持折光儀：杭州陸恒生物科技有限公司；UV2800紫外-可見分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 歐李果汁與牛奶復(fù)合益生菌飲料加工工藝流程

歐李果實→分選清洗→破碎去核→打漿→酶解過濾→歐李果汁→添加脫脂牛奶→調(diào)整糖度→滅菌→接種→發(fā)酵→成品

1.3.2 操作要點

歐李果汁制備：選取成熟度一致、無損傷、無病蟲害的歐李果實洗凈，去核，用榨汁機破碎得到45%的歐李果漿，按照30 mg/kg添加果膠酶[25]，于35 ℃水浴下酶解5 h，用四層紗布過濾得歐李果汁。

添加脫脂牛奶和白砂糖：在上述歐李果汁中添加12%的脫脂牛奶（固形物含量10%），調(diào)整糖度后倒入發(fā)酵容器中。

菌種活化：將-80 ℃冷凍保藏的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌甘油管解凍至室溫，在超凈工作臺分別將100 μL、300 μL、300 μL菌種接種至MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

種子液制備：配制基質(zhì)，基質(zhì)配方為酵母提取物10 g，白砂糖20 g，蒸餾水1000 mL，攪拌均勻后，置于高速離心機中，轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min獲取上清液，115 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至室溫，備用。挑取上述活化的植物乳桿菌接種于滅菌后的基質(zhì)中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h；分別挑取上述活化的嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌于滅菌后的基質(zhì)中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

滅菌：將調(diào)配好的歐李果汁與牛奶于90 ℃水浴下滅菌8 min。

接種：冷卻至室溫后在超凈工作臺中接種5%種子液。

發(fā)酵：于37 ℃培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵一定時間，即得歐李果汁與牛奶復(fù)合益生菌飲料。

1.3.3 歐李果汁與牛奶復(fù)合益生菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

選取菌株（LA∶BA=1∶1、LP∶BA=1∶1、LP∶LA=1∶1、LP∶LA∶BA=1∶1∶1，V/V）、歐李果汁添加量（35%、40%、45%、50%、55%、60%）、脫脂牛奶添加量（0、4%、8%、12%、16%、20%）、糖度（10°Bx、11°Bx、12°Bx、13°Bx、14°Bx、15°Bx）、接種量（3%、4%、5%、6%、7%、8%）和發(fā)酵時間（24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h）進行單因素考察，以探討其對總抗氧能力（T-AOC）和乳酸菌活菌數(shù)的影響。

（2）響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗設(shè)計基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以總抗氧化能力（Y1）和活菌數(shù)（Y2）為響應(yīng)值，選取歐李果汁添加量（A）、脫脂牛奶添加量（B）、接種量（C）和發(fā)酵時間（D）為自變量，采用4因素3水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，以確定歐李果汁與牛奶復(fù)合益生菌飲料最佳發(fā)酵工藝。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 檢測方法

總抗氧化能力（T-AOC）測定：采用總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒；活菌數(shù)測定：按照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同發(fā)酵菌株對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響

圖1 不同發(fā)酵菌株對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of different fermentation strains on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由圖1可知，接種菌株為LA∶BA（1∶1）時，飲料的總抗氧化能力和活菌數(shù)達到峰值，分別為127.81 U/mL和8.14 lg（CFU/mL），這可能和LA生長速度較快有關(guān)。綜合考慮，選擇最佳發(fā)酵菌株及配比為LA∶BA=1∶1。

2.1.2 歐李果汁添加量對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響

圖2 歐李果汁添加量對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of Cerasus humilis juice addition on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由圖2可知，隨歐李果汁添加量的增加，飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。歐李果汁添加量在35%～50%范圍時，總抗氧化能力和活菌數(shù)逐漸上升，在歐李果汁添加量為50%時，達到峰值，分別為127.81 U/mL和8.20 lg（CFU/mL），繼續(xù)增加歐李果汁添加量，總抗氧化能力和活菌數(shù)均下降。歐李果汁添加量比較低時，飲料中營養(yǎng)成分和多酚含量較少，影響了乳酸菌的生長。歐李果汁添加量過高時，飲料pH降低，不利于乳酸菌生長。綜合考慮，選擇最佳歐李果汁添加量為50%。

2.1.3 脫脂牛奶添加量對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響

圖3 脫脂牛奶添加量對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of skimmed milk addition on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由圖3可知，當(dāng)脫脂牛奶添加量＜16%時，隨著脫脂牛奶添加量的增加，兩個指標(biāo)隨之增加，在脫脂牛奶添加量為16%時達到峰值，分別為127.54 U/mL和8.32 lg（CFU/mL）。當(dāng)脫脂牛奶添加量＞16%之后，總抗氧化能力和活菌數(shù)下降。脫脂牛奶可為乳酸菌的生長提供氮源，促進乳酸菌的生長，但當(dāng)脫脂牛奶添加量增加到一定程度時，脫脂牛奶中的蛋白質(zhì)會與多酚結(jié)合形成沉淀，影響飲料的總抗氧化能力[24]。綜合考慮，選擇最佳脫脂牛奶添加量為16%。

2.1.4 糖度對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響

圖4 糖度對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of sugar content on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由圖4可知，隨著糖度的增加，飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)變化較小，說明糖度對飲料發(fā)酵影響較小，這可能是由于歐李果汁本身含糖量較高，能夠滿足乳酸菌的生長需求。綜合考慮成本和口感，選擇最佳糖度為12°Bx。

2.1.5 接種量對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響

圖5 接種量對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of inoculum on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由圖5可知，接種量在3%～7%范圍內(nèi)時，兩個指標(biāo)隨著接種量的增加而隨之增加，在接種量為7%時達到峰值，分別為133.53 U/mL和8.38 lg（CFU/mL）。當(dāng)接種量＞7%時，總抗氧化能力和活菌數(shù)下降，這可能是由于增加接種量會導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物濃度的增加，不利于菌種的繼續(xù)生長。綜合考慮，選擇最佳接種量為7%。

2.1.6 發(fā)酵時間對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響

圖6 發(fā)酵時間對飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由圖6可知，總抗氧化能力和活菌數(shù)趨勢一致，隨著發(fā)酵時間的延長先上升后下降，活菌數(shù)在40 h達到峰值，為8.39 lg（CFU/mL），總抗氧化能力在48 h達到峰值，為126.99 U/mL。發(fā)酵時間過長，會導(dǎo)致菌種老化自溶，使飲料總抗氧化能力和活菌數(shù)下降。綜合考慮，選擇最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇歐李果汁添加量（A）、脫脂牛奶添加量（B）、接種量（C）和發(fā)酵時間（D）進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，共計29次試驗，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

利用Design-Expert 8.0.6分析軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸分析，得到總抗氧化能力（Y1）和活菌數(shù)（Y2）的預(yù)測模型：

Y1=131.16-6.43A-5.92B-0.78C+2.18D-0.92AB-1.94AC-1.74AD+2.45BC+3.16BD+2.04CD-13.19A2-3.55B2+0.59C22+2.78D2

Y2=8.41+0.017A-0.098B-0.096C-0.052D-0.008 691AB+0.13AC+0.12AD+0.08BC-0.061BD+0.024CD-0.20A2+0.051B2-0.000 299 1C2-0.03D2

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型決定系數(shù)R2=0.940 3，說明回歸方程有較高擬合度和相關(guān)性，模型預(yù)測值能較好地反映實際值[25]，可以對歐李與牛奶復(fù)合益生菌飲料發(fā)酵總抗氧化能力進行分析和預(yù)測。一次項A、B、二次項A2對結(jié)果影響達到極顯著水平（P＜0.01），一次項D、二次項B2對結(jié)果影響達到顯著水平（P＜0.05）。各因素對總抗氧化能力的影響順序分別是：歐李果汁添加量＞脫脂牛奶添加量＞發(fā)酵時間＞接種量。

表3 以總抗氧化能力為評價指標(biāo)的響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface tests results using total antioxidant capacity as evaluation indicator

由表4可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型決定系數(shù)R2=0.896 2，說明回歸方程有較高擬合度和相關(guān)性，模型預(yù)測值能較好地反映實際值，可以對歐李與牛奶復(fù)合益生菌飲料發(fā)酵活菌數(shù)進行分析和預(yù)測。一次項B、C、交互項AC、AD、二次項A2對結(jié)果影響達到極顯著水平（P＜0.01），一次項D對結(jié)果影響達到顯著水平（P＜0.05）。各因素對總抗氧化能力的影響順序分別是：脫脂牛奶添加量＞接種量＞發(fā)酵時間＞歐李果汁添加量。

表4 以活菌數(shù)為評價指標(biāo)的響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface tests results using viable cell number as evaluation indicator

2.2.2 各因素交互作用分析

圖7 各因素交互作用對活菌數(shù)影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on viable cell number

各因素對總抗氧化能力的交互作用不顯著。由圖7可知，歐李果汁添加量和接種量，歐李果汁添加量和發(fā)酵時間對活菌數(shù)交互作用響應(yīng)面曲面較陡，即歐李果汁添加量和接種量，歐李果汁添加量和發(fā)酵時間交互作用顯著。其余各因素對活菌數(shù)交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗證試驗

以總抗氧化能力和活菌數(shù)為響應(yīng)指標(biāo)，擬合出的最佳發(fā)酵工藝為歐李果汁添加量48.93%，脫脂牛奶添加量12.25%，接種量6.10%，發(fā)酵時間40.65 h，此條件下總抗氧化能力理論值為141.48 U/mL，活菌數(shù)理論值為8.72 lg（CFU/mL）。為了便于實際操作，修正工藝參數(shù)為歐李果汁添加量49%，脫脂牛奶添加量12.3%，接種量6%，發(fā)酵時間41 h。接種菌種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌，糖度12°Bx，在此優(yōu)化條件下重復(fù)發(fā)酵3次，得到總抗氧化能力實際值為143.33 U/mL，與理論值相對誤差為1.31%，活菌數(shù)實際值為8.70 lg（CFU/mL），與理論值相對誤差為0.23%，與理論值基本一致，可為實際發(fā)酵提供依據(jù)。

3 結(jié)論

本試驗以歐李果汁和牛奶為主要原料制作歐李復(fù)合益生菌飲料，以總抗氧化能力和活菌數(shù)為評價指標(biāo)，針對發(fā)酵菌種、歐李果汁添加量、脫脂牛奶添加量、糖度、接種量和發(fā)酵時間進行單因素考察，并在此基礎(chǔ)上對歐李果汁添加量、脫脂牛奶添加量、接種量和發(fā)酵時間進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化，得到歐李益生菌飲料最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵菌株植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌（1∶1），歐李果汁添加量49%，脫脂牛奶添加量12.3%，糖度12°Bx，接種量6%，發(fā)酵時間41 h。得到的飲料色澤鮮艷，口感適宜，總抗氧化能力為143.33 U/mL，活菌數(shù)為8.70 lg（CFU/mL）。利用乳酸菌進行發(fā)酵，可以改善歐李風(fēng)味，為歐李的綜合開發(fā)利用提供新途徑。