丹酚酸A誘導(dǎo)小鼠白色脂肪組織褐變改善肥胖

來建飛 錢倩宇 丁秦超 李松濤 竇曉兵 陳林 朱林文思

肥胖已成為世界范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的第五大因素，并可引起許多并發(fā)癥［1-2］。丹酚酸A（Sal A）是丹參中的水溶性天然多酚類化合物單體，具有抗氧化、抗炎癥、促進(jìn)脂肪酸代謝等多種藥理特性及作用［3-6］。白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)兩種主要的脂肪組織［7-9］。外界藥物或寒冷刺激誘導(dǎo)可降低小鼠體重增加并刺激小鼠WAT褐變，增加棕色脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）的表達(dá)［10-12］。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射丹酚酸A可誘導(dǎo)小鼠脂肪組織中UCP1和PGC-1α等蛋白高表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)高脂高糖飲食誘導(dǎo)的肥胖。本文從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確Sal A促進(jìn)脂肪細(xì)胞褐變的作用，為以Sal A為主治療肥胖癥的老藥新用研發(fā)提供新思路，對(duì)解決肥胖問題具有潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 （1）儀器：倒置顯微鏡，日本OLMPUS公司，型號(hào)CKX31；微量紫外分光光度儀，美國Quawell公司，型號(hào)QWell 5000；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Beckman公司，型號(hào)5541RB31614；垂直電泳槽，美國 Bio-Rad 公司，型號(hào) Mini PROTEAN? Tetra Cell；電泳儀，美國Bio-Rad公司，型號(hào)Power Pac；TMHC制冰機(jī)，浙江寧波格蘭特公司，型號(hào)XB-100；電子精密天平，美國Ohaus，型號(hào)AR1140。（2）材料：丹酚酸A，成都德思特生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：96574-01-5；生理鹽水，美國Sigma公司，貨號(hào)：S0817；普通固體飼料，美國Open Source Diet 公司，貨號(hào)：D12450B；標(biāo)準(zhǔn)高脂肪固體飼料，美國Open Source Diet 公司，貨號(hào)：批號(hào)D12492。Anti-UCP1 Antibody，美國Abcam公司，貨號(hào)：ab10983；Anti-PGC-1α Antibody美國Abcam公司，貨號(hào)：ab43003；Anti-GAPDH antibod，武漢博士德生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：A00227；Goat anti-Mouse IgG antibody，武漢博士德生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：BA1050。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）動(dòng)物造模及組織樣本處理：將40只雄性C57BL/6小鼠置于（23±2）℃恒溫環(huán)境中喂養(yǎng)8周，可自由取食、飲水，光照/黑暗周期為12 h。小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)環(huán)境后隨機(jī)分為4組，每組10只，即正常飲食組（ND組，腹腔注射生理鹽水溶液），高脂高糖飲食組（HFD組，腹腔注射生理鹽水溶液），高脂高糖飲食與腹腔內(nèi)注射20 mg/kg Sal A組（HFD-LS組），高脂肪和高碳水化合物飲食與腹腔內(nèi)注射40 mg/kg Sal A組（HFD-HS組）。前2周，實(shí)驗(yàn)老鼠均被喂食常規(guī)鼠糧；2周后，HFD組和Sal A處理組的小鼠均改為高脂高糖飲食8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有小鼠均被處死，收集附睪脂肪并儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。

1.3 觀察指標(biāo) （1）小鼠的體重與每日食物攝入量：喂養(yǎng)期間，每周測(cè)量一次體重。（2）組織形態(tài)學(xué)觀察：附睪的脂肪樣本切成段（10 μm）使用Leica 低溫恒溫器，然后用蘇木精和伊紅染色（圓）可視化附睪的白色脂肪組織（eWAT）中脂肪細(xì)胞的大小，使用顯微鏡觀察4個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域內(nèi)細(xì)胞數(shù)量（100×100 μm），計(jì)算平均值。（3）基因與蛋白檢測(cè)：取適量小鼠附睪脂肪組織在冰上剪碎并置于試管中，分別提取RNA與蛋白質(zhì)，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR（RT-PCR）檢測(cè)脂肪組織內(nèi)棕色化相關(guān)基因的表達(dá)水平，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)脂肪組織內(nèi)UCP1和PGC-1α的蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠的體重、每日食物攝取量比較 HFD-LS組和HFD-HS組的小鼠體重均明顯小于HFD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 A.四組小鼠體重增長比較，#P＜0.05，★P＜0.05；B.四組小鼠每日食物攝取量比較

2.2 四組小鼠的附睪脂肪組織形態(tài)學(xué)觀察和附睪脂肪重量比較 見圖2。

圖2 A.附睪脂肪組織形態(tài)學(xué)照片；B.附睪脂肪組織重量；與ND組比較，#P＜0.05；與HFD組比較，★P＜0.05

2.3 四組小鼠附睪脂肪組織H&E染色結(jié)果比較 Sal A可減輕肥胖小鼠附睪脂肪細(xì)胞中的脂肪過度積累，見圖3。

2.4 四組小鼠附睪脂肪組織內(nèi)棕色化相關(guān)基因的表達(dá)水平比較 Sal A可促使肥胖小鼠附睪脂肪中棕色脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）高表達(dá)。見圖4。

2.5 四組小鼠附睪脂肪組織內(nèi)UCP1和PGC-1α的蛋白表達(dá)水平比較 Sal A可促使肥胖小鼠附睪脂肪中UCP1和PGC-1α蛋白高表達(dá)，見圖5。

圖3 A.四組小鼠附睪脂肪組織H&E染色eWAT中脂肪細(xì)胞大小（100 μM）；B.四組小鼠附睪脂肪組織H&E染色切片的細(xì)胞數(shù)量/單位面積；與ND組比較，#P＜0.05；與HFD組比較，★P＜0.05

圖4 四組小鼠附睪脂肪組織內(nèi)棕色化相關(guān)基因的表達(dá)水平比較；與ND組比較，#P＜0.05；與HFD組比較；★P＜0.05

圖5 四組小鼠附睪脂肪組織內(nèi)UCP1和PGC-1α的蛋白表達(dá)水平比較；與ND組比較，#P＜0.05；與HFD組比較；★P＜0.05

3 討論

最新研究進(jìn)展表明，某些藥理食材成分可促進(jìn)哺乳動(dòng)物增加能量消耗，減少脂肪堆積，促進(jìn)白色脂肪褐變。本課題組初步試驗(yàn)采用長期高脂高糖飲食喂養(yǎng)建立C57BL/6小鼠肥胖病模型。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹酚酸A干預(yù)可逆轉(zhuǎn)C57BL/6小鼠由高脂高糖飲食誘導(dǎo)的肥胖，且具有預(yù)防肥胖的作用。WANG等［13］研究表明，丹酚酸A可通過激活A(yù)MPK和線粒體改善肥胖相關(guān)疾病癥狀。然而，目前尚未有從促進(jìn)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生熱量來增加能量消耗即褐色化方面來探討丹酚酸A治療多種肥胖相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究。查閱大量國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)后，本課題組首次開展研究Sal A對(duì)HFD小鼠肥胖與WAT褐變的影響。筆者在C57BL/6小鼠中測(cè)試Sal A腹腔注射對(duì)HFD誘導(dǎo)的肥胖的影響，結(jié)果見圖2。通過測(cè)量小鼠附睪脂肪組織的eWAT質(zhì)量來評(píng)估HFD誘導(dǎo)的脂肪過度積累，結(jié)果顯示與HFD組相比，HFDLS組和HFD-HS組小鼠的體重明顯降低，HFD組的附睪脂肪重量顯著減輕，且在食物攝入量上沒有差異。由此可見，在C57BL/6小鼠上Sal A具有預(yù)防高脂高糖飲食引起的肥胖的作用。C57BL/6小鼠附睪脂肪組織H&E染色eWAT中脂肪細(xì)胞大小比較，經(jīng)Sal A處理的小鼠附睪脂肪組織內(nèi)的脂肪細(xì)胞更小。

肥胖的特征是脂肪異常沉積，因此有必要研究脂肪組織中基因或蛋白質(zhì)的變化。為了進(jìn)一步探討Sal A預(yù)防肥胖的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)分析與WAT褐變相關(guān)的基因和蛋白，結(jié)果表明Sal A可在基因水平上促進(jìn)WAT中棕色脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）的高表達(dá)，Sal A顯著增加小鼠脂肪組織中UCP1和PGC-1α的mRNA和蛋白表達(dá)水平。UCP1是一種產(chǎn)熱蛋白，在BAT中大量表達(dá)，WAT中UCP1表達(dá)的增加誘導(dǎo)了米色脂肪細(xì)胞的形成［14］。為進(jìn)一步確定Sal A對(duì)小鼠附睪脂肪組織棕色化水平的調(diào)節(jié)作用，筆者又進(jìn)行蛋白水平的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂高糖飲食誘導(dǎo)會(huì)造成小鼠脂肪組織的產(chǎn)熱標(biāo)志蛋白UCP1表達(dá)下降，而注射Sal A的小鼠附睪脂肪組織中UCP1和PGC-1α的蛋白表達(dá)水平較HFD組有顯著升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，Sal A可促使棕色脂肪細(xì)胞的標(biāo)志蛋白UCP1在肥胖小鼠附睪脂肪中高表達(dá)；Sal A具有促進(jìn)WAT褐變的能力，從而增加了能量消耗和產(chǎn)熱。DESHMUKH等［15］指出，人的成年期也會(huì)發(fā)生褐變，這表明白色脂肪組織的褐變是一種很有希望的策略，可以預(yù)防和/或治療肥胖和相關(guān)的共病，如2型糖尿病［16］。Sal A誘導(dǎo)WAT褐變?cè)黾幽芰肯膹亩鴾p少脂肪積累，達(dá)到預(yù)防肥胖疾病的作用。因此，Sal A可能是預(yù)防與治療肥胖癥及其代謝并發(fā)癥的候選藥物。