肺炎支原體DNA 復制、IP-10 水平及SAT 與重癥支原體肺炎患兒病情的相關性分析

朱祎宏，周冬平，陳杭

支原體肺炎（MPP）是由肺炎支原體（MP）引起的兒童常見疾病[1]。重癥支原體肺炎（SMPP）治療難度大，患兒病死率較高[2]。SMPP 的早期診斷和病情評估對于提升疾病治療效果、改善患兒預后具有十分重要的意義。肺炎支原體DNA（MP-DNA）可直接準確反映病原載量，有助于了解SMPP患兒病情嚴重程度[3]。人干擾素誘導蛋白10（IP-10）是一種多功能趨化因子，在機體炎癥調節、嗜中性粒細胞聚集及獲得性免疫應答啟動中發揮關鍵作用[4]。實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（SAT）是檢測肺炎支原體感染狀態和判斷患者病情狀況的新型分子生物學檢測技術，其在肺炎支原體的早期診斷中具有明顯效果[5]。因此，本研究探討 MP-DNA、IP-10 及 SAT 在 SMPP 患兒病情評估中的應用及意義，取得了一定的進展，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省長興縣中醫院 2016 年 1 月年至 2018 年 12 月收治的SMPP 患兒60 例。納入標準：（1）符合中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015 年版）》[6]中關于 SMPP 的診斷標準；（2）患兒家屬均對本研究內容知情，自愿參與本研究并簽署知情同意書；（3）入院時MP-Ab（IgM+IgG）≥1∶160；（4）急性期/恢復期定義雙份血清抗體滴度升高4 倍及以上。排除標準：（1）合并免疫功能缺陷或障礙、先天性疾病及其他慢性基礎疾病者；（2）肝腎等重要臟器功能障礙及血液系統疾病者；（3）不耐受本研究藥物治療或臨床檢查手段者；（4）臨床資料不全者。其中男34 例，女26例；年齡 6 ～ 13 歲，平均（9.2±1.6）歲。

1.2 方法 所有患兒在急性期、恢復期及治療后清晨空腹抽取 5ml 靜脈血，3 000 r/min離心10 min取上清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測C反應蛋白（CRP）、白細胞介素 6（IL-6）、IL-8、血沉（ESR）水平。試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，所有操作嚴格依照試劑盒說明書進行。于急性期、恢復期及治療后檢測MP-DNA 復制倍數，取患兒咽拭子提取物加入 0.9%氯化鈉注射液中，震蕩低溫過夜，12 000 r/min 離心5 min 取沉淀，取50 ml DNA 提取液加入，100℃處理 10 min，離心，PCR 擴增，檢測MP-DNA 復制倍數。于急性期、恢復期及治療后取咽拭子溶于0.5 ml 0.9%氯化鈉注射液中，加入裂解液0.5 ml，震蕩混勻，采用MP-SAT 試劑盒提取樣本RNA，熒光定量PCR 擴增，試劑盒購自上海仁度生物科技有限公司。閾值曲線與樣本曲線交叉點橫坐標為dt，以dt ＞40 min 為陰性，dt≤35min 為陽性，對于35 ＜dt≤40 min 的樣本重新測定。

1.3 統計方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以均值±標準差表示，采用t 檢驗或單因素方差分析；計數資料采用2檢驗；相關性分析采用Spearman 分析。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMPP患兒各階段臨床指標比較SMPP 患兒急性期 CRP、IL-6、IL-8、ESR、MP-DNA 復制倍數、IP-10 及 MP-SAT 陽性率均高于平穩恢復期、治療后（均 P ＜ 0.05），見表 1。

2.2 MP-DNA 復制倍數、IP-10 及 MPSAT 陽性與炎性細胞因子的相關性Spearman 相關性分析顯示MP-DNA 復制倍數、IP-10 及 MP-SAT 陽性率與CRP、IL-6、IL-8、ESR 水平均呈正相關（均 P ＜ 0.05），見表 2。

2.3 MP-DNA 復制倍數、IP-10 及 MPSAT 陽性與SMPP 患兒急性發作的相關性 MP-DNA 復制倍數、IP-10 及 MPSAT 陽性與SMPP 疾病急性發作均呈正相關（r=0.577、0.596、0.680，均P＜0.05）。

2.4 MP-DNA 復制倍數、IP-10 及 MPSAT轉陰時間與SMPP患兒病情痊愈的相關性 MP-DNA復制倍數、IP-10 水平越高，SAT轉陰時間越長、患兒病情痊愈時間越長（均P＜0.05），見表3；MP-SAT轉陰時間與MP-DNA 復制倍數、IP-10及病情痊愈時間均呈正相關（r=0.525、0.471、0.436，均 P ＜ 0.05）。

3 討論

SMPP 臨床表現為長期發熱、低氧血癥和呼吸困難等，嚴重者可出現支原體腦病、全身炎性反應綜合征等嚴重并發性，威脅患兒的生命安全。臨床上對于SMPP的病情監測一直缺少靈敏性和特異性較高的生物標志物，因此容易出現病情延誤的情況。

目前，MP的實驗室早期診斷主要以血清學檢測為主，本研究SMPP 患兒中CRP、IL-6、IL-8 級 ESR 明顯升高，表明在 SMPP 患兒中 NF-kB 信號通路異常激活，機體炎癥因子水平活躍，免疫狀態出現明顯異常；并且SMPP 患兒急性發作期各炎性細胞因子水平更高。由于SMPP 患兒機體炎性因子增加和免疫功能異常，機體受支原體破壞氣道上皮細胞的功能降低，致使患兒出現胸腔積液、氣道黏連等惡性反應，使得患兒肺功能嚴重損傷，從而導致了SMPP 患兒急性期肺功能指標均顯著低于平穩恢復期和治療后各指標水平。本研究SMPP 急性期患兒 MP-DNA 復制倍數明顯高于平穩恢復期、治療后，提示 MP-DNA 與SMPP 患兒病情存在明顯相關性。研究顯示[7]，SMPP 患兒急性期 MP-DNA 復制倍數增加的原因與支原體耐藥和SMPP 患兒纖毛功能受損有關：目前，支原體耐藥的現象越來越普遍，支原體基因位點突變導致SMPP患兒機體內支原體無法徹底清除，引起疾病反復；同時，由于 SMPP 患兒纖毛功能不同程度受損，導致其清除異物及病原菌的功能降低，從而使得SMPP 疾病急性進展。

表1 SMPP 患兒各階段臨床指標比較

表2 MP-DNA 復制倍數、IP-10 及MP-SAT 陽性與炎性細胞因子的相關性

表3 不同MP-SAT 轉陰時間MP-DNA 復制倍數、IP-10 及患兒病情痊愈時間比較

同時，本研究還探討MP-DNA復制水平、IP-10 及 MP-SAT 與 SMPP 發生發展的相關性，結果顯示MP-DNA復制水平、IP-10 及 SAT 陽性率與 CRP、IL-6、IL-8、ESR 水平存在明顯正相關（均 P ＜0.05），且與SMPP 疾病急性發作存在明顯正相關性（均 P ＜ 0.05）。MP-DNA 復制倍數、IP-10 水平越高，SAT 轉陰時間越長，患兒病情痊愈時間越長，MP-SAT轉陰時間與MP-DNA 復制倍數、IP-10及病情痊愈時間存在明顯正相關性（均P ＜0.05）。這說明肺炎支原體DNA 復制、IP-10 水平及SAT 可作為SMPP 患兒體內炎癥反應嚴重程度及病情評估的有效依據。

綜上所述，肺炎支原體DNA 復制、IP-10 水平及SAT 陽性率與SMPP 患兒機體炎癥因子水平、病情存在明顯相關性，在SMPP 急性期患兒中存在肺炎支原體 DNA 高復制、IP-10 水平升高及SAT 檢測陽性率升高的情況，其臨床檢測對于SMPP患兒的診斷和治療具有重要意義。