IL-18對人骨髓間充質干細胞成骨分化的作用

倪飛飛，徐慶，王亞輝，李建軍

1 中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004；2 天津市天津醫院；3 安徽醫科大學附屬六安市人民醫院

隨著當今社會經濟和交通運輸業的快速發展，多發性骨折合并腦、肺、腹腔臟器損傷患者有增加趨勢，臨床治療面臨很多挑戰。脾破裂合并肢體骨折是臨床常見的高能量多發傷，全脾切除是其首要急救措施。本課題組前期研究發現，復合外傷骨折合并脾破裂而行脾切除的患者中骨折愈合明顯延遲，考慮與脾切除后機體免疫炎性功能改變導致與骨折愈合相關的炎性因子明顯減少進而影響骨折愈合有關［1-2］。IL-18 屬于IL-1 家族，是前炎癥細胞因子之一。研究顯示IL-18 在骨缺損修復過程中起重要作用，對骨髓間充質干細胞（BMSC）、成骨細胞，破骨細胞均有影響，但具體機制尚不明郎［3-4］。IL-18 主要由巨噬細胞產生，而脾臟是機體細胞免疫和體液免疫的中心，內含豐富巨噬細胞、淋巴細胞及炎性因子同時能高效表達IL-18，這些免疫細胞及炎性因子與機體損傷修復密切相關［5-6］。研究表明，骨折后BMSC 會首先募集到骨折處，第一時間參與骨折修復；骨折后BMSC 所處的骨折微環境對細胞分化及功能發揮起著重要調節作用，骨損傷后骨折斷端局部為血腫炎性微環境［7］，炎性細胞因子對BMSC成骨分化可能存在促進或抑制作用。因此有必要進一步探究細胞因子IL-18對BMSC成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人骨髓間充質干細胞（hBMSC，中國醫科大學盛京醫院干細胞研究中心提供）、重組人IL-18（美國R&D 公司）、DMEM- F12 培養基（美國Hyclone）、胎牛血清（無錫依科賽）、青霉素、鏈霉素（大連美倫）、胰蛋白酶（美國Gibco）、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸（美國Sigma 公司）、茜素紅S（碧云天公司）、堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒（碧云天公司）、特異性轉錄因子-2（Runx2）一抗（Proteintech 公司）、骨形態發生蛋白-2（BMP2）一抗（Proteintech 公司）、骨橋蛋白（OPN）一抗（Proteintech公司）、GAPDH一抗（Proteintech 公司）、兔二抗（北京中杉金橋）、PCR引物、PCR試劑盒、DEPC水和Trizol試劑均購于Takara公司；高速低溫離心機和CO2培養箱（美國賽默飛公司）、倒置相差顯微鏡+圖像采集系統（Nikon，Eclipse NI）、熒光定量PCR儀（美國Life technologies，ABI7500 Fast），一次性25 cm2細胞培養瓶、6 孔培養板、離心管等細胞培養相關耗材（無錫Nest 公司）、細胞破碎儀（美國Next advance，BBY24M）。

1.2 hBMSC 培養 取原代hBMSC 置于DMEM-F12生長培養液（含89%F12-DMEM、15%FBS、1%青-鏈霉素），放于37 ℃、5%CO2，培養箱內培養24 h 后進行首次換液棄除非貼壁細胞，之后每隔48 h 進行1次換液，當細胞貼壁大約90%時進行傳代，選用長勢良好的第3代細胞進行相關實驗。

1.3 經典成骨誘導液的配制 在上述DMEM-F12生長培養液基礎上配制成骨誘導液，終濃度分別為：地塞米松1×10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉3.3 mmol/L、維生素C 16.67 mg/L。無菌條件下用DMEM-F12生長培養液定容至100 mL，充分混勻，4 ℃保存。

1.4 hBMSCs 分組 取生長良好的第3 代hBMSC每孔2×104個接種于6 孔培養板，并隨機分成兩組。于細胞匯合率為80%～90%時，對照組采用經典成骨誘導液培養，觀察組采用經典成骨誘導液+質量濃度為100 ng/mL 的重組人IL-18 培養液培養；每孔2 mL，每48 h更換1次培養液。

1.5 Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達檢測 兩組分別繼續培養1、3、7 d 后收集細胞，用Trizol 充分裂解細胞提取總RNA。PCR 反應條件：94 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30s，共40 個周期。選用Runx2、BMP2、OPN 相應引物序列，人β-actin 作為內參，采用實時熒光定量PCR法檢測Runx2、BMP2、OPN mRNA表達。

1.6 Runx2、BMP2、OPN 蛋白表達檢測 兩組分別繼續培養1、3、7 d 后收集細胞，提取蛋白。SDSPAGE 凝膠電泳：80 V 30 min，120 V 70 min。200 mA 70 min 將凝膠中蛋白轉膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h。TBST 洗膜，一抗孵育4 ℃過夜。第2 日，常溫下二抗孵育2 h。然后PVDF 膜用TBST洗3 次，每次10 min，ECL 曝光。采用Western blotting 法檢測Runx2、BMP2、OPN 蛋白表達，GAPDH 作為內參。

1.7 ALP染色 兩組細胞經成骨誘導培養7 d后棄培養液，4%的多聚甲醛1 mL 固定15 min，加入DDH2O 1 mL，輕柔沖洗3 次。按照BCIP/NBT ALP顯色試劑盒說明書配制ALP 染色劑染色，室溫避光孵育6 h 后，輕輕吸去染色試劑，使用DDH2O 終止顯色反應，在40倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 鈣結節茜素紅染色 兩組細胞經成骨誘導培養7 d 后進分別用PBS 沖洗3 次，4%多聚甲醛固定1 min，各組加入DDH2O 1 mL，輕柔沖洗3次。1%茜素紅染液（pH 4.2）染色，37 ℃孵育0.5～1 h，倒掉茜素紅染液，DDH2O加入終止反應。在40倍光鏡下觀察成骨細胞礦化結節形成情況。

1.9 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件進行處理分析。計量資料符合正態分布采用±s表示，組間比較采用重復測量的方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hBMSC 生長情況 原代hBMSC 接種后約2 h細胞迅速貼壁、伸展恢復成梭形，細胞均勻生長，原代細胞培養4 d后即可進行傳代，以后平均4～5 d傳代1次，傳至第3代時，細胞生長良好呈均一梭形，形態清楚。相差倒置顯微鏡下觀察第3代hBMSC呈長梭形或多角形生長，類似成纖維細胞，細胞體豐滿，細胞質均勻。

2.2 兩組Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達 兩組成骨誘導1、3、7 d，Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。觀察組隨誘導時間延長，Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達增加，不同時點Runx2、BMP2、OPN mRNA 表達差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組不同時點BMP2、Runx2、OPN mRNA表達（n=3，±s）

表1 兩組不同時點BMP2、Runx2、OPN mRNA表達（n=3，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與本組1 d比較，#P＜0.05；與本組3 d比較，&P＜0.05。

2.3 兩組Runx2、BMP2、OPN 蛋白表達 兩組成骨誘導1、3、7 d，Runx2、BMP2、OPN蛋白表達比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。觀察組隨誘導時間延長，Runx2、BMP2、OPN 蛋白表達增加，不同時點Runx2、BMP2、OPN mRNA 蛋白表達差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組不同時點BMP2、Runx2、OPN 蛋白表達（n=3，±s）

表2 兩組不同時點BMP2、Runx2、OPN 蛋白表達（n=3，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與本組1 d比較，#P＜0.05；與本組3 d比較，&P＜0.05。

2.4 兩組ALP染色情況 光學顯微鏡下觀察可見，觀察組成骨誘導7 d后酶活性細胞胞質呈藍色塊狀沉淀，顯色較深；，而對照組則顯色較淡。見圖1。

圖1 兩組ALP染色

2.5 兩組茜素紅染色情況 觀察組成骨誘導7d 后其礦化結節明顯增多且紅色深染，大小不一，呈團塊狀；對照組礦化結節少且紅色淺染。見圖2。

圖2 兩組茜素紅染色

3 討論

我們前期的臨床隨訪及動物模型證實骨折合并脾切除會造成骨折延遲愈合，這表明脾切除后免疫功能會受到顯著影響。骨折后在損傷修復的初始階段，各種炎性相關的細胞因子被釋放在損傷部位同時對骨折組織周圍的各類細胞都有著趨化作用及促進增殖、加速修復的作用。骨髓來源的間充質干細胞可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等多種細胞以及肌腱、韌帶等多種結締組織［8-9］。IL-18在人體內廣泛分布，在抗感染、免疫調節、抗腫瘤、免疫炎癥反應中發揮著重要作用［10］。研究顯示IL-18 可由成骨細胞產生，通過粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）促進成骨同時抑制破骨細胞活性［11］。并且有研究表明骨質疏松病人經過12 個月抗骨質疏松治療后血中IL-18 明顯升高且骨密度增加，此研究表明IL-18對骨質疏松患者是一種有益的保護因子［12］。最近研究顯示，IL-18抑制破骨細胞形成、促進PTH 骨合成代謝作用尤其明顯［13］。同時有報道表明IL-18 可上調類風濕性關節炎中滑膜細胞破骨形成關鍵調控因子RANKL的產生，也促進了M-CSF、GM-CSF 及OPN 的生成［14］。本研究結果顯示，hBMSC 經成骨誘導7 d 后鈣化結節的茜素紅染色呈橘紅色塊狀和片狀，表明IL-18對鈣化結節的形成有明顯促進作用，可誘導hBMSC 向成骨細胞分化。

Runx2 屬于Runx 蛋白家族，能誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞和成骨細胞分化，同時也是骨細胞成熟的關鍵轉錄因子。研究發現Runx2也是BMP下游的重要調節因子，在骨修復與重建中發揮重要作用［15］。BMP 作為成骨細胞生長的啟動因子，可調控細胞核內成骨相關基因的表達從而誘導未分化的BMSC不可逆地分化為成骨細胞，在成骨過程中BMSC 在局部BMP-2的刺激下發生化學趨化、聚集后分化形成軟骨和骨［16］，BMP2也可通過不同的Smads通路誘導Runx2 表達，并可通過調節Runx2 等其他成骨相關轉錄因子來影響BMSC 的成骨分化［17］。OPN是一種調節蛋白，可由成骨細胞分泌產生，參與骨的重建、吸收和礦化。研究顯示OPN 可以明顯促進hBMSC 的遷移能力，使hBMSC 聚集到損傷部位參與骨組織修復［18］。同時OPN 被作為成骨細胞分化成熟的標志之一，在發育成熟的成骨細胞中、晚期階段表達，參與骨基質的礦化和吸收過程。成骨細胞成熟最終會形成鈣結節，而鈣結節的形成是hBMSC 成骨分化的最直接的證據［19］。本研究顯示，hBMSC 成骨誘導1、3、7 d 后，IL-18 對hBMSC 成骨分化相關的轉錄因子Runx2、BMP2、OPN 在轉錄水平（mRNA）和蛋白表達水平都有顯著影響，且隨著干預時間延長呈上升趨勢。同時ALP 染色結果顯示，誘導7 d后，觀察組較對照組明顯深染，表明IL-18增強hBMSC 的ALP 活性，增強誘導成骨分化能力。ALP 是反映成骨細胞成熟的重要標志性酶，ALP 活性越高表明成骨分化能力越強［20］。

總之，IL-18 能明顯誘導hBMSC 的成骨分化作用，進一步證明脾臟在骨折愈合過程發揮重要作用。因此骨折合并脾損傷需手術治療時術中應盡量保留脾臟，以保證術后患者免疫功能的穩定。但有關IL-18參與成骨作用的確切機制尚需進一步研究。