外周血類黏蛋白1 樣蛋白3 水平與過敏性哮喘患兒Th1/Th2平衡的關系

喻維，汪忠鴻，李冰，魯焱，王仁杰，黃文娟

1 荊州市婦幼保健院，湖北荊州434000；2 長江大學第一附屬醫院 荊州市第一人民醫院

過敏性哮喘（AA）是常見的一種過敏性疾病，病理表現為氣道高反應性和氣道重構［1-2］。AA 占成人、兒童哮喘的比例分別為50%、80%，AA 大多起源于兒童時期，且兒童哮喘經過早期規范管理和治療可以逆轉［3］，因此早期治療對AA 患兒健康成長具有重要意義。近年研究顯示，哮喘本質為氣道慢性炎癥，與中性粒細胞、T 淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞等多種炎癥細胞密切相關［4］。類黏蛋白1 樣蛋白3（ORMDL3）基因為目前為止發現與兒童時期哮喘發生關聯依據最充分的基因，主要表達于外周血淋巴細胞和肝臟，可通過增加未折疊蛋白反應和激活T 淋巴細胞參與AA 發生及發展［5-6］。研究發現，輔助性T 細胞亞群1/2（Th1/Th2）平衡狀態與哮喘發生密切相關［7］。本研究分析AA患兒外周血ORMDL3 和Th1/Th2 水 平 變 化 情 況，探 討ORMDL3 與Th1/Th2的關系，以期為AA防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2019 年10 月—2020 年5 月荊州市婦幼保健院收治AA 患兒64 例（AA 組），男34 例、女30 例，年 齡3～14（8.40 ± 2.52）歲；BMI 18～26（22.39 ± 1.89）kg/m2；均臨床表現為不同程度的呼吸困難、喘鳴、咳嗽。納入標準：①符合《中國過敏性哮喘診治指南》（第1 版，2019 年）中AA 的診斷標準［8］；②年齡3～14 歲；③家屬或監護人均知情同意參與研究；④無其他呼吸疾病者；⑤無呼吸道感染者。排除標準：①精神異常者；②其他心肺疾病者；③近1 周使用抗組胺、白三烯類藥物及糖皮質激素者；④β2受體激動劑、糖皮質激素過敏者；⑤有哮喘家族史及自身免疫性疾病者。另選取48例同時期體檢健康兒童為對照組，男20 例、女28 例，年齡3～14 歲（8.87±2.44）歲，BMI 17～27（22.98±2.27）kg/m2；與AA 組比較，其年齡、性別、BMI 無統計學差異（P均＞0.05）。本研究經本院倫理委員會批準實施。

1.2 血液標本采集 采集AA 組入院、對照組體檢當天空腹外周靜脈血6 mL，其中4 mL 加入EDTA 抗凝，轉移至無菌PE 管；另2 mL 進行3 000 r/min 離心10 min，取上清液，置于無菌PE 管；均放入-80 ℃冰箱中待檢。

1.3 血清IgE、嗜酸性粒細胞檢測 取2 mL 待檢血清，采用酶聯吸附法（上海晶抗生物工程有限公司）測定血清IgE 水平，LH750 全自動血細胞分析儀（貝克曼庫爾特生物科技有限公司）檢測嗜酸性粒細胞并計算嗜酸性粒細胞比率（EOSR）。

1.4 肺功能指標檢測 采用NIOX VERO 呼出分析儀（瑞典索爾納Aerocrine 公司）檢測呼出氣一氧化氮（FeNO）；采用美能AS-407 肺功能儀（成都柏威斯科技有限公司）檢測受檢者安靜睡眠時達峰容積比［呼氣達峰容積/每分鐘通氣量（VPEF/VE）］、達峰時間比［呼氣達峰時間/呼氣時間（TPTEF/TE）］。

1.5 外周血Th1、Th2 細胞水平測定 取1 mL EDTA 抗凝外周血，RPMI1640 培養基（北京中科邁晨科技有限公司）等體積稀釋外周血100 μL，加入10 μL 刺激劑，CO2培養箱（上海五相儀器儀表有限公司，CO2濃度5%；溫度37 ℃）培養4～6 h?；靹?，加入10 μL CD3-PC5、CD8-PC7，避光孵育15 min；加入固定液，再次孵育15 min。加入3 mL 磷酸緩沖鹽溶液，3 000 r/min離心5 min，半徑8 cm，棄上清。設置檢測管和對照管，各管加入100 μL 破膜和溶血液，再加入10 μL IL-4-藻紅蛋白單克隆抗體、IFN-γ-異硫氰酸熒光素單克隆抗體（上海安研商貿有限公司）避光孵育15 min。各管加入3 mL 磷酸緩沖鹽溶液，3 000 r/min 離心5 min，棄上清。0.5 mL 磷酸緩沖鹽溶液重懸細胞，貝克曼庫爾特MoFlo XDP 流式細胞儀檢測Th1、Th2 細胞百分比。各樣本每次檢測1×104個細胞。

1.6 外周血ORMDL3 mRNA 水平測定 取3 mL EDTA 抗凝外周血，總RNA 抽提試劑（Trizol，北京索萊寶科技有限公司）提取外周血總RNA，TaKaRa 逆轉錄試劑盒轉錄合成cDNA。加入ORMDL3 上游引物5'-GCAAG-GCGAGGCTGCTAACCCACT-3'，下 游引物5'-GGGATAAGCACGCTCATCAGGG-3'，RT-PCR擴增。擴增條件：95 ℃預變性90 s，95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40 次。各管設置3 個復孔，以GAPDH 做內參校正，上游引物5'-AGGTCGGAGTCAACGGAT-3'，下游引物5'-TCCTGGAAGATGGTGATG-3'，反應結束后得到各反應管Ct，2-ΔΔCt法計算外周血ORMDL3 mRNA相對表達量。

1.7 統計學方法 選用SPSS26.0 統計學軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，采用χ2或Fisher檢驗；采用Pearson相關性分析、多因素Logistics回歸分析AA的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血液及肺功能檢測指標比較 AA組血清IgE、EOSR、FeNO 和外周血ORMDL3 mRNA、Th2 水平高于對照組，VPEF/VE、TPTEF/TE、Th1 水平和Th1/Th2低于對照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組血液及肺功能檢測指標比較（±s）

表1 兩組血液及肺功能檢測指標比較（±s）

檢測指標IgE（IU/mL）EOSR（%）FeNO（ppb）VPEF/VE TPTEF/TE ORMDL3 mRNA Th1（%）Th2（%）Th1/Th2 AA組（n=64）258.87±84.39 7.37±2.44 25.39±6.43 15.27±4.94 13.56±3.28 2.24±1.06 12.35±4.57 3.63±1.24 3.37±1.17對照組（n=48）43.90±10.36 5.38±1.20 18.65±5.18 25.57±7.44 19.39±4.22 1.01±0.23 16.79±5.64 1.70±0.52 9.84±2.52 t P 17.530 5.195 5.954 8.794 8.228 7.893 4.600 10.127 18.119＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

2.2 AA 患兒外周血ORMDL3 mRNA、Th1/Th2 的相關性及其影響二者的因素 Pearson 相關性分析顯示，AA 患兒外周血ORMDL3 mRNA 與Th1/Th2呈負相關（r=-7.103，P＜0.05）。AA 患兒外周血ORMDL3 mRNA 與IgE、EOSR、FeNO 呈正相關，與VPEF/VE、TPTEF/TE 呈負相關；Th1/Th2 與IgE、EOSR、FeNO 呈負相關，與VPEF/VE、TPTEF/TE 呈正相關。見表2。

表2 影響AA患兒外周血ORMDL3 mRNA和Th1/Th2相關因素

2.3 AA 危險因素的Logistics 回歸分析 以IgE、EOSR、FeNO、VPEF/VE、TPTEF/TE、ORMDL3 mRNA、Th1/Th2 為自變量，是否發生AA（是=1，否=0）為因變量，多因素Logistics 回歸分析顯示，IgE 和ORMDL3 mRNA 為AA 發生獨立危險因素，Th1/Th2為保護因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 AA危險因素的Logistics回歸分析

3 討論

哮喘是一組多種炎癥細胞、氣道結構細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病，與環境、遺傳、免疫因素等多種因素有關［9］。據調查顯示，目前我國約有3 000萬哮喘患者，其中14 歲以下城市兒童患病率高達3.02%，6歲以下更高［10］。反復喘息發作不僅給患兒身心健康造成了嚴重影響，也加重了家庭及社會的經濟負擔。目前尚不完全明確哮喘的發病機制，但大量研究證實，T 淋巴細胞在氣道慢性炎癥性中發揮重要作用［11］。Th1 和Th2 均來源于輔助性T 細胞亞群，Th1可分泌腫瘤壞死因子-β、IL-12、IFN-γ，Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-13。Th1 與Th2 為重要效應細胞，Th1 分泌的IFN-γ 能抑制Th2 功能和分化，Th2 分泌的IL-4 能抑制Th1 功能和分化［12］。生理狀態下，Th1 和Th2 的功能和細胞數量是穩定的，若平衡被打破，則會引起疾病。研究顯示，Th2 分泌的細胞因子能促進IgE 合成，誘導EOS 前體分化，促進EOS 浸潤，是導致Th1/Th2 失衡及哮喘發生的基礎［13］。有人通過抑制小鼠Th1 極化、增強Th2 極化發現，哮喘小鼠組織中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1和3表達明顯提升，進一步證實Th1/Th2失衡會增加哮喘發生率［14］。本研究結顯示，AA組外周血Th1/Th2 水平明顯低于對照組，說明AA 患兒Th1/Th2 平衡出現明顯破壞，機體免疫力受損；且AA 組外周血Th2 水平明顯高于對照組，Th1 水平明顯低于對照組，說明AA 發生與Th2 功能亢進和Th1功能低下有關［15］。

ORMDL3 為ORM 家族一員，位于人染色體17q21，序列高度保守。研究發現，1 型糖尿?。?6］、類風濕關節炎［17］、系統性紅斑狼瘡［18］等自身免疫性疾病患者血清中ORMDL3 mRNA 呈高表達，說明ORMDL3 基因與免疫系統失調有關。研究發現，小鼠肺組織中ORMDL3 mRNA 呈低表達，而胎兒肺組織中ORMDL3 mRNA 呈高表達［19］，并進一步證實其與兒童哮喘發生有關。上調ORMDL3 mRNA 表達后，哮喘患者氣道平滑肌的收縮和增殖能力明顯提升，導致患者氣道高反應性明顯提升，病情加重［20］。本研究顯示，AA 組外周血ORMDL3 mRNA 水平明顯高于對照組，說明ORMDL3 mRNA 與兒童AA 發生有關。國內外多項研究證實，哮喘患者外周血中ORMDL3 mRNA、Th1/Th2 水平與EOSR 有密 切關系，二者能通過相互作用影響AA 患者，加重患者病情［21-22］。本研究顯示，AA 組血清IgE、EOSR、FeNO水平明顯高于對照組，VPEF/VE、TPTEF/TE 明顯低于對照組，分析是AA 患兒存在明顯的呼吸道免疫炎性反應，氣道內附著大量黏性液體，增加了起到阻力，損傷肺功能。AA 患兒外周血ORMDL3 mRNA、Th1/Th2 水 平 與IgE、EOSR、FeNO、VPEF/VE、TPTEF/TE 具有明顯相關性，ORMDL3 mRNA 為AA發生獨立危險因素，Th1/Th2 為保護因素；外周血ORMDL3 mRNA 高表達可導致Th1/Th2 失衡，AA 發生風險增加。外周血ORMDL3 mRNA 變化與AA 發生的關系存在以下機制：①ORMDL3 表達產物能增加未折疊蛋白反應，其作為一種內源性炎癥途徑，可通過轉錄激活因子6、蛋白激酶R 樣內質網激酶、肌醇酶細胞信號轉導通路激活核因子-κB，活化巨噬細胞，導致氣道慢性炎癥發生；同時核因子-κB 還能調控絕大部分氣道重塑相關的炎癥介質和細胞因子，促進氣道重塑［23］。②ORMDL3表達產物能導致內質網鈣泵調節異常，產生內質網應激，促進氣道平滑肌過度釋放大量細胞因子，參與氣道重塑［24］。③過度ORMDL3 表達能誘導IL-6、IL-8 激活磷酸化細胞外信號調節激酶/基質金屬蛋白酶-9信號通路，促進氣道重塑［25］。

綜上所述，AA 患兒外周血ORMDL3 mRNA 水平明顯升高，Th1/Th2 處失衡狀態，為AA 發生的獨立影響因素，可能是評估AA病情的良好指標。