轉移抑制性長鏈非編碼RNA 對肺癌細胞增殖及凋亡的影響

宋淑范，王迪，陳德才

沈陽市第四人民醫院，沈陽110031

肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率均位居腫瘤性疾病的首位［1］。目前，肺癌的治療效果仍不甚滿意，其5 年生存率低于20%；因此研究肺癌的發病機制對于制定肺癌預防策略，探究新的治療方法具有重要意義［2］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200 nt 的內源性非編碼的RNA 分子，它可以通過改變染色體構象、改變基因轉錄、基因翻譯等起到調控基因表達的作用［3］。轉移抑制性長鏈非編碼RNA（lncRNA LIMT）是一種定位于12 號染色體的lncRNA，具有7 個外顯子序列［4］。已有研究顯示，在乳腺癌、肝癌中存在lncRNA LIMT 的低表達，其水平與患者預后相關，但在肺癌中的作用及機制仍未完全明確［5-6］。本研究探討lncRNA LIMT 對肺癌細胞增殖及凋亡的影響，旨在為肺癌治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640 培養基，購自Gibco 公司；Liofectamine2000，購自Invitrogen 公司；lncRNA LIMT過表達質粒pEGFP-C1-LIMT、空質粒pEGFP-C1-NC、敲減質粒siRNA-LIMT 及其siRNA-NC，均購自于廣州市銳博生物科技有限公司；CCK-8 細胞增殖實驗試劑盒，購自于北京全式金生物有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染凋亡試劑盒，購自于凱基生物有限公司；表皮生長因子受體（EGFR）蛋白一抗、磷酸化EGFR（p-EGFR）蛋白一抗、細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）蛋白一抗、磷酸化ERK（p-ERK），購自于武漢三鷹公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取凍存的人肺癌A549 細胞，進行細胞復蘇，復蘇后重懸至含10%胎牛血清的RPIM1640培養基中，并在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下進行培養。在顯微鏡下觀察A549細胞形態，并與說明書中的形態進行對比；當A549細胞融合度為95%時進行細胞傳代，并取二代細胞進行試驗。

1.2.2 細胞轉染 取對數生長期A549 細胞鋪6 孔板，待A549 細胞融合度達70%～80%時應用lipofectamine 2000 分別轉染lncRNA LIMT 過表達質粒pEGFP-C1-LIMT 及其空質粒pEGFP-C1-NC、敲減質粒siRNA-LIMT 及其空質粒siRNA-NC，并相應作為pEGFP-C1-LIMT 組、pEGFP-C1-NC 組、siRNA-LIMT組、siRNA-NC 組。所有操作按照說明書進行，轉染后將6 孔板放入培養箱中細胞培養，培養條件為37 ℃、5%CO2濃度、飽和濕度。48 h 后可收集細胞，應用熒光顯微鏡檢測細胞熒光驗證其轉染效率，并取細胞進行后續研究。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 用胰酶消化細胞，并應用PBS進行細胞重懸，收集各組細胞，調整細胞密度為2×104個/mL，96孔板鋪入各組細胞，100 μL/孔，每組設3個復孔，將96孔板放入培養箱中培養，培養條件為37 ℃、5%CO2濃度、飽和濕度。分別于細胞轉染后24、48、72 h向每個孔加入CCK-8細胞增殖檢測試劑10 μL/孔，并用酶標儀檢測450 nm處吸光值（OD450值）。

1.2.4 細胞凋亡檢測 用胰酶消化細胞，并應用PBS重懸細胞。收集各組細胞，細胞計數后加入PBS調整細胞密度至1×106個/mL，加入100 μL 1×binding buffer，輕輕混勻后將各組細胞分別加入到1.5 mL的EP管中。避光條件下加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI staining solution 5 μL進行染色，輕輕混勻，室溫下反應15 min。加入400 μL 1×binding buffer，1 h內應用流式細胞儀進行檢測，檢測結果以散點圖呈現，其中右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞。

1.2.5 lncRNA LIMT表達檢測 采用RT-qPCR法。取各組轉染的A549 細胞，經研磨后加入Trlzol 裂解液提取總RNA 分子，應用逆轉錄試劑盒進行發轉錄生成cDNA，并進行基因擴增。lncRNA LIMT 上游引物為5'-TTACCCACCCTACTTTCCC-3'，下游引物為5'-TTGTGCCCATCTACCAGG-3'，內參為β-actin，上游引物為5'-CACTGTCCCATCACGAGG-3'，下游引物為5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'，反應條件為：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，共40個循環，并應用2-ΔΔCt進行定量分析。

1.2.6 EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK 蛋白表達檢測 采用Western boltting法。取各組轉染的A549細胞，加入蛋白裂解液RIPA混勻后充分裂解，3 000 r/min離心10 min，離心半徑6 cm。取上清后進行蛋白定量，然后進行電泳、轉模、封閉等，加入EGFR 蛋白一抗、p-EGFR 蛋白一抗、ERK 蛋白一抗、p- ERK 蛋白一抗孵育過夜，TBST 沖洗，避光加入生物學二抗孵育1 h，以GAPDH 為內參應用Image Lab 軟件測量蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 應用SPSS22.0 統計學軟件進行分析；計量資料符合正態分布以±s表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較應用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力 CCK8 增殖試驗顯示，四組細胞增殖能力比較有統計學差異（P＜0.05）；pEGFP-C1-LIMT 組A549 細胞24、48、72 h 增殖能力均低于pEGFP-C1-NC 組（P均＜0.05），siRNA-LIMT 組A549細胞24、48、72 h增殖能力均高于siRNA-NC 組（P均＜0.05）。見表1。

表1 四組細胞不同時間點增殖能力比較（±s）

表1 四組細胞不同時間點增殖能力比較（±s）

組別細胞OD450值n 3 3 3 3 pEGFP-C1-LIMT組pEGFP-C1-NC組siRNA-LIMT組siRNA-NC組0 h 0.36±0.07 0.35±0.05 0.37±0.06 0.36±0.04 24 h 0.58±0.07 0.39±0.06 0.60±0.08 0.44±0.05 48 h 0.68±0.08 0.42±0.05 1.13±0.09 0.58±0.05 72 h 1.38±0.11 0.62±0.08 2.13±0.15 1.22±0.07

2.2 各組細胞凋亡情況 流式細胞儀檢測顯示，四組細胞凋亡情況比較有統計學差異（P＜0.05）；A549細胞凋亡pEGFP-C1-LIMT 組［（74.46 ± 4.28）%］高于pEGFP-C1-NC 組［（52.33 ± 5.23）%］（P＜0.05），siRNA-LIMT 組［（41.36 ± 4.23）%］低于siRNA-NC組［（52.54±4.88）%］（P＜0.05）。

2.3 各組細胞lncRNA LIMT 表達 RT-qPCR 檢測結果顯示，四組細胞lncRNA LIMT 水平比較有統計學差異（P＜0.05）；lncRNA LIMT 水平pEGFPC1-LIMT 組（12.78 ± 1.82）高 于pEGFP-C1-NC 組（0.94 ± 0.12）（P＜0.05），siRNA-LIMT 組（0.07 ±0.01）低 于 siRNA-NC 組（0.81 ± 0.16）（P＜0.05）。

2.4 各組細胞EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK 蛋白表達 Western boltting 檢測顯示，pEGFP-C1-LIMT組A549 細胞中EGFR、p-ERK 蛋白低于pEGFP-C1-NC 組，p-EGFR、ERK 蛋白高于pEGFP-C1-NC 組（P均＜0.05）；siRNA-LIMT 組A549 細胞中EGFR、p-ERK 蛋白高于siRNA-NC 組，p-EGFR、ERK 蛋白低于siRNA-NC 組（P均＜0.05）。見表2。

表2 四組細胞EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK蛋白表達比較（±s）

表2 四組細胞EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK蛋白表達比較（±s）

組別pEGFP-C1-LIMT組pEGFP-C1-NC組siRNA-LIMT組siRNA-NC組n 3 3 3 3 EGFR 1.35±0.15 3.28±0.21 4.23±0.32 3.07±0.23 p-EGFR 3.56±0.26 1.67±0.11 0.58±0.08 1.78±0.18 ERK 3.05±0.22 2.08±0.15 1.14±0.11 2.35±0.23 p-ERK 0.57±0.08 1.62±0.13 3.46±0.25 1.38±0.15

3 討論

肺癌是起源于支氣管黏膜和（或）支氣管腺體的惡性腫瘤。根據《全球疾病死亡率及負擔》研究報告顯示，全球每年因肺癌死亡人數超過170萬例，其中我國為55 萬例，約占全球肺癌死亡人數的33%，占我國腫瘤死亡人數的25%［7］。大量研究顯示，大氣污染、吸煙、電離輻射以及反復發生的肺部感染、肺結核等均與肺癌的發生有密切關系［8-10］。臨床上對于非小細胞肺癌仍主張早期進行手術切除治療，但由于肺癌發病隱匿，大多數患者就診時已處于晚期，喪失了手術治療的機會。臨床數據顯示，對于Ⅰ期患者接受手術治療后5 年生存率56%～73%，而晚期肺癌患者5 年生存率不足15%［11］，其中肺癌侵襲和轉移是導致患者死亡的重要因素。腫瘤侵襲和轉移過程是一個涉及多種基因異常表達的多因素、多步驟的復雜過程，研究肺癌發生、發展、侵襲和轉移的分子機制有助于肺癌的早期診斷、制定新的治療方案、明確預后等。

過去很長一段時間內，RNA 在人體基因表達中作用一直被忽視；直至人類基因組計劃的完成，人們發現人類基因組中超過90%的基因為RNA 分子，其中僅2%的RNA 能夠翻譯為蛋白質，其余RNA 分子不編碼蛋白質，被稱為非編碼RNA［12］。非編碼RNA包括轉錄RNA、核仁小RNA、微小RNA 及lncRNAs等。起初人們認為lncRNAs是一類沒有生物學功能的RNA 分子。近年來研究證實，lncRNAs 可以調控基因核內轉運、干擾基因轉錄、參與染色質修飾等起到調控基因表達的作用，并參與了機體遺傳、發育、細胞分化、細胞周期調控等眾多生命活動［13-14］。lncRNA LIMT 是近年來新發現的一種lncRNA 分子，又稱為LINC01089，是一種與腫瘤的發生、發展有密切相關的lncRNA 分子［15］。已有研究表明，lncRNA LIMT 可以抑制乳腺癌、肺癌的發生和發展。ZHAO等［16］報道，與正常乳腺細胞比較，乳腺癌MCF 細胞中lncRNA LIMT 表達下調，通過表皮生長因子刺激MCF 細胞可以導致lncRNA LIMT 進一步下調，并認為lncRNA LIMT可以通過抑制表皮生長因子起到抑制乳腺癌發生、發展的作用。王春剛等［17］研究發現，lncRNA LIMT 可以通過調控轉化生長因子β 信號通路，抑制肺癌細胞惡性轉變。但目前關于肺癌組織中lncRNA LIMT 表達情況及其對肺癌細胞增殖、凋亡影響仍缺乏相關報道。

為了研究lncRNA LIMT在肺癌中是否具有生物學功能，我們應用CCK8 試驗觀察不同組別A549 細胞的增殖能力，應用流式細胞儀觀察不同組別A549細胞的凋亡能力。結果顯示pEGFP-C1- LIMT 組A549 細胞增殖能力降低，凋亡比例升高，而siRNALIMT 組A549 細胞增殖能力升高，凋亡比例降低。表明lncRNA LIMT 具有抑制肺癌A549細胞增殖、促進其凋亡的作用。當lncRNA LIMT降低時可以引起肺上皮細胞、腺細胞增殖不受控制、凋亡受到抑制，并促進細胞惡變。本結果也提示通過對lncRNA LIMT進行調控可能是肺癌精準治療的新策略。

目前已有研究表明，EGFR 信號通路在調節細胞和組織穩定中發揮重要作用［18］。EGFR 是上皮細胞增殖和信號傳導的重要受體，與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、血管生成及轉移有密切關系。正常情況下EGFR 處于非磷酸化狀態，當EGFR 發生磷酸化時可以導致其功能降低［19-20］。EGFR 突變也是肺癌發生的重要原因。研究表明，10%～44%的肺癌中存在EGFR 突變［21］。ERK 是MAPK 信號通路中的重要分子，具有調節細胞增殖、分化、維持組織正常形態的功能［22］。研究表明，當ERK 被磷酸化后可以激活MAPK 信號通路，并導致細胞進入G1期，細胞增殖速度加快，引起細胞惡變［23］。本研究結果顯示，pEGFP-C1-LIMT組A549細胞中EGFR、p-ERK蛋白呈低表達，p-EGFR、ERK 蛋白呈高表達；與此相反，siRNA-LIMT 組A549 細胞中EGFR、p- ERK 蛋白呈高表達，p-EGFR、ERK 蛋白顯呈低表達，表明lncRNA LIMT 可以促進EGFR 磷酸化，進而導致EGFR功能降低，抑制肺癌細胞的增殖。而lncRNA LIMT還可以通過抑制ERK 磷酸化，從而抑制MAPK 信號通路，并組織細胞進入G1期，起到抑制肺癌細胞的增殖，促進其凋亡的作用。

綜上所述，lncRNA LIMT 在肺癌組織中低表達，lncRNA LIMT 可以抑制肺癌細胞的增殖，促進肺癌細胞凋亡，其機制可能與lncRNA LIMT 調控EGFGERK信號有關。