環(huán)境化學(xué)物暴露對(duì)妊娠期糖尿病生物信息學(xué)的影響

劉素琴，崔靜，孫健平，隋樹淼

1 青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266011；2 青島市疾病預(yù)防控制中心 青島市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院；3 萊西市院上中心衛(wèi)生院

妊娠期糖尿病（GDM）是在妊娠期間發(fā)生的自發(fā)性高血糖，是一種常見的妊娠并發(fā)癥［1］。盡管分娩后GDM 癥狀體征會(huì)消退，但其對(duì)母親及兒童的健康可產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)影響，并導(dǎo)致肥胖和糖尿病的代際惡性循環(huán)［2-3］。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟估計(jì)，2019年全球有2 040 萬(wàn)20～49 歲的女性受GDM 影響，其患病率高達(dá)15.8%，且報(bào)道GDM 患病率隨著年齡增加而增長(zhǎng)，45～49 歲 女 性 中GDM 的 患 病 率 更 是 高 達(dá)37.0%［4］。研究顯示，GDM 受遺傳、營(yíng)養(yǎng)及生活方式等諸多因素影響［5］；但這些因素并不能完全解釋GDM 流行的嚴(yán)重性，越來(lái)越多的證據(jù)顯示環(huán)境化學(xué)物與GDM 的發(fā)生密切相關(guān)［6］。環(huán)境化學(xué)物廣泛存在在空氣、水和食物中，砷、環(huán)境細(xì)顆粒物、雙酚A及其代謝物、持久性有機(jī)污染物等均影響GDM 的發(fā)生發(fā)展［7-10］。目前雖然已經(jīng)有了部分環(huán)境化學(xué)物對(duì)GDM 影響的研究，但是尚無(wú)二者交互作用分子層面全面而深入的報(bào)道。因此本研究采用生物信息學(xué)方法分析環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)GDM 影響的分子機(jī)制，為GDM的預(yù)測(cè)與防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 GDM 共同關(guān)聯(lián)基因篩選 2021年1月19日以“gestational diabetes mellitus”，“Homo sapiens”［porgn：__txid9606］為檢索詞在Pubmed 的Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，共檢索到14個(gè)可能與GDM 關(guān)聯(lián)的基因芯片，將檢索到含有非GDM 和GDM 樣本的基因芯片納入本研究。采用GEO2R對(duì)基因芯片中的非GDM組和GDM組的基因樣本進(jìn)行中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化分析，選取非GDM 組與GDM 組分別處在同一水平的基因芯片中的基因樣本導(dǎo)出后，篩選出P＜0.05 且∣lg FC∣＞1 的基因納入本研究。2021 年2 月2 日以“gestational diabetes mellitus”為檢索詞在比較毒理基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（CTD，其網(wǎng)址為http：//ctdbase. org/）進(jìn)行檢索，篩選出環(huán)境化學(xué)物質(zhì)影響GDM 直接表達(dá)的基因納入本研究。將通過(guò)GEO 和CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘出的基因通過(guò)jveen 在線軟件篩選出GDM共同關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行分析。

1.2 基因富集分析 采用DAVID 在線軟件（網(wǎng)址為https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)GDM共同關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行富集分析，富集分析主要包括基因本體論（GO）分析和信號(hào)通路分析。GO 分析主要包括生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分等，當(dāng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。信號(hào)通路分析是描述基因間各種生物學(xué)通路與代謝途徑的方法，本研究采用BIOCARTA信號(hào)通路分析法。

1.3 蛋白互作富集分析 采用String 在線分析軟件與Cytoscape 軟件的GeneMANIA 插件對(duì)GDM 共同關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行蛋白互作分析，并預(yù)測(cè)GDM 共同關(guān)聯(lián)蛋白間的共表達(dá)、共定位等作用以及其節(jié)點(diǎn)蛋白。采用Cytoscape 軟件的GeneMANIA 插件和Mcode插件對(duì)GDM共同關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行分子復(fù)合物檢測(cè)（Mcode），并挖掘每個(gè)Mcode模塊的節(jié)點(diǎn)蛋白。

1.4 影響Mcode 模塊環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的篩選 通過(guò)Excel 將各Mcode 模塊的節(jié)點(diǎn)蛋白/基因與CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因比較，篩選出影響各Mcode模塊的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 GDM 共同關(guān)聯(lián)基因 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示有4 套與GDM 相關(guān)聯(lián)的基因芯片，見表1。與GDM 相關(guān)聯(lián)的基因芯片中P＜0.05 且∣lg FC∣＞1 的基因有84 個(gè)，CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示與GDM 相關(guān)聯(lián)的基因共有12 924個(gè)。通過(guò)jveen在線軟件分析顯示，兩種數(shù)據(jù)庫(kù)共有59個(gè)與GDM共同關(guān)聯(lián)的基因。

表1 與GDM相關(guān)基因芯片基本信息

2.2 基因富集 GO 分析顯示，GDM 共同的關(guān)聯(lián)基因主要集中在細(xì)胞外基質(zhì)（P＜0.01 且FDR=0.002）、血管再生（P＜0.01 且FDR=0.022）、胚胎肢體形態(tài)發(fā)育（P＜0.01 且FDR=0.046）、單生物細(xì)胞-細(xì)胞黏附（P＜0.01 且FDR=0.046）等生物學(xué)進(jìn)程以及細(xì)胞外區(qū)域（P＜0.01 且FDR=0.008）等細(xì)胞組分。見表2。BIOCARTA 信號(hào)通路富集分析顯示，GDM 共同的關(guān)聯(lián)基因主要參與了IL-10 抗炎（P=0.10 且FDR=1.00）、Ghrelin（P=0.10 且FDR=1.00）等信號(hào)通路。見表3。

表3 GDM關(guān)聯(lián)的基因BIOCARTA通路分析

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò) String 在線軟件與Cytoscape軟件中GeneMaNIA 分析顯示，GDM 共同的關(guān)聯(lián)蛋白共有52 條邊，平均蛋白節(jié)點(diǎn)度為1.62，局部聚類系數(shù)為0.434，其中共表達(dá)的蛋白有1 048對(duì)，共定位的有127對(duì)，基因互作的有287對(duì)，通路的有19對(duì)，物理互作的有54 對(duì)，預(yù)測(cè)的有22 對(duì)，蛋白域共享的有68對(duì)，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 GDM 關(guān)聯(lián)基因Mcode 模塊及其影響環(huán)境化學(xué)物質(zhì) Cytoscape 軟件Mcode 模塊化分析顯示，與T2DM 關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因共有6個(gè)基因模塊，最復(fù)雜模塊是Mcode 1，其包含9 個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白，分別為COL4A1、FILIP1L、ROR1、FOXF1、LOXL1、CXCL12、DDR2、IGFBP5、TAGLN；其次為Mcode 6，包含8 個(gè)節(jié) 點(diǎn) 蛋 白，分 別 為TGFBI、FAT1、EMCN、GPX7、CD44、LDB2、VASH1、COLEC12。影響各個(gè)模塊的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)主要為砷、莠去津、鎘、二嗪農(nóng)、二甲雙胍、農(nóng)藥等。見表4。

3 討論

環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)GDM 的影響已引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注，但目前缺乏系統(tǒng)的關(guān)于環(huán)境化學(xué)物質(zhì)暴露與GDM 效應(yīng)間分子生物學(xué)機(jī)制的闡釋。本研究顯示有59 個(gè)與GDM 共同關(guān)聯(lián)的基因。GO 分析與GDM 關(guān)聯(lián)的基因主要集中在細(xì)胞外基質(zhì)組織、血管再生、胚胎肢體形態(tài)發(fā)育、單生物細(xì)胞-細(xì)胞黏附以及細(xì)胞外區(qū)域等；BIOCARTA 信號(hào)通路富集分析GDM 共同的關(guān)聯(lián)基因主要參與了IL-10 抗炎信號(hào)通路、Ghrelin 等信號(hào)通路；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示GDM 共同的關(guān)聯(lián)蛋白共有6 個(gè)模塊，影響各個(gè)模塊的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)主要為砷、莠去津、鎘、二嗪農(nóng)、二甲雙胍、農(nóng)藥等。

表4 GDM關(guān)聯(lián)基因Mcode模塊及其影響環(huán)境化學(xué)物質(zhì)

GDM 是孕期發(fā)生的一系列的葡萄糖代謝異常，其發(fā)病機(jī)理尚未完全了解，但免疫炎性因子是GDM發(fā)病的主要機(jī)制之一。砷、鎘、莠去津等環(huán)境化學(xué)物質(zhì)作為全球關(guān)注的熱點(diǎn)，已有研究表明能夠引起IL-10廣泛參與的免疫炎性反應(yīng)［13］。

IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，可以由多種細(xì)胞合成和分泌，同時(shí)其還可以抑制多種炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子。研究顯示GDM 患者的血漿IL-10 水平顯著低于健康對(duì)照者，且低IL-10 水平與GDM 患者的胰島素抵抗負(fù)相關(guān)，這表明低水平IL-10與GDM的胰島素抵抗相關(guān)［14］。此外，還有研究顯示IL-10 等位基因與GDM 易感性風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)［15］。IL-10 不僅在機(jī)體的免疫反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且參與到許多組織和器官的細(xì)胞活化、增殖、分化等過(guò)程中，這也從側(cè)面印證了我們的研究，環(huán)境化學(xué)物通過(guò)影響IL-10抗炎信號(hào)通路來(lái)影響GDM 者的細(xì)胞外基質(zhì)組織、血管再生、胚胎肢體形態(tài)發(fā)育、單生物細(xì)胞-細(xì)胞黏附以及細(xì)胞外區(qū)域等生物學(xué)進(jìn)程或細(xì)胞組分。

Ghrelin 是一種致食性肽，主要由胃底細(xì)胞分泌，能夠調(diào)節(jié)食物攝入和能量代謝，其在調(diào)節(jié)肥胖、糖尿病等疾病中起到重要的作用［16］。機(jī)體的Ghrelin 水平受飲食、運(yùn)動(dòng)、生活方式及環(huán)境等多種因素影響，但目前還未有Ghrelin 受環(huán)境化學(xué)物質(zhì)影響的報(bào)道。妊娠期糖尿病涉及Ghrelin 相關(guān)的食物攝入和能量代謝，但目前鮮有報(bào)道妊娠期糖尿病與Ghrelin關(guān)系的研究，有研究顯示Ghrelin激動(dòng)劑能夠治療糖尿病性胃輕癱、厭食癥及病理性體重不足，而Ghrelin 受體抑制劑可能對(duì)肥胖者減重及改善葡萄糖代謝有著治療價(jià)值［17］。有研究報(bào)道妊娠期女性有較低的血漿Ghrelin，且產(chǎn)后12周內(nèi)這種低水平持續(xù)存在［18］；另有報(bào)道GDM 女性在產(chǎn)后2 天血清Ghrelin水平較高，但尿中Ghrenlin 水平較低［19］。而上述一些列的差異可能是由于GDM 患者體內(nèi)炎性因子分泌異常而導(dǎo)致Ghrelin 代謝紊亂［20］。考慮到目前關(guān)于GDM 與Ghliren 的研究較少，因此對(duì)二者關(guān)系及機(jī)制進(jìn)行深入而細(xì)致的探討是有必要的

綜上所述，砷、莠去津、鎘、二嗪農(nóng)、二甲雙胍、農(nóng)藥等環(huán)境化學(xué)物可能通過(guò)影響IL-10、Ghrelin等信號(hào)通路來(lái)影響GDM 的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而影響胎兒的細(xì)胞外基質(zhì)組織、血管再生、胚胎肢體形態(tài)發(fā)育、單生物細(xì)胞-細(xì)胞黏附以及細(xì)胞外區(qū)域等生物學(xué)進(jìn)程或細(xì)胞組分。因此，研究環(huán)境化學(xué)物與GDM 之間分子生物學(xué)機(jī)制，可以為更加精準(zhǔn)地研究、預(yù)防、干預(yù)和治療GDM提供新思路。