淫羊藿治療糖皮質激素性骨質疏松癥分子機制的網絡藥理學分析

許坤 龐堅* 張潔帆 王用玉 趙詠芳 郭海玲

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院石氏傷科醫學中心，上海 200120 2.上海市中醫藥研究院骨傷科研究所，上海 200120

糖皮質激素性骨質疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)是由于長期使用糖皮質激素造成骨密度和骨量下降、骨質結構遭到破壞，導致骨脆性增強、骨折風險增加的代謝性骨病，是最常見的繼發性骨質疏松癥[1]。至今，糖皮質激素(glucocorticoid，GC))類藥物在臨床仍是無可替代的，雖然GC的使用會產生明顯的不良反應，包括骨量丟失和骨折[2-3]。接受GC長期治療的患者中，約10 %以上被臨床診斷發生骨折，而30 %～40 %的患者具有椎骨骨折的影像學證據[4-5]。GIOP已經成為世界范圍的日益嚴重的健康問題。在補充鈣劑、維生素D與改變生活方式的基礎上，雙膦酸鹽類藥物仍是受推薦的一線藥物[6]，但隨著雙膦酸鹽治療時間的延長，骨壞死、非典型股骨骨折的發生率都見增加[7]，可能由于骨吸收抑制劑與GC同時使用，導致骨形成進一步減少，從而妨礙骨的重建所致。因此，目前GIOP的臨床治療仍然存在著廣泛的爭議[8]。

淫羊藿[9]又名仙靈脾，來源于毛茛目小檗科淫羊藿屬植物。祖國傳統醫學認為其性溫，味辛、甘，入肝、腎經，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效，常用于治療腎陽虛衰、筋痿骨軟、風濕痹痛等癥。多項文獻研究[10-11]顯示，在防治骨質疏松的中醫藥處方中，淫羊藿為其中使用頻率最高的藥物。而現代藥理學研究[12]顯示，淫羊藿組分能促進成骨細胞分化、抑制破骨細胞活性與抑制GC誘導的骨細胞凋亡，故而淫羊藿在GIOP防治領域具有廣闊研究空間與開發潛力。淫羊藿的成分復雜，進一步探索淫羊藿治療GIOP的具體藥物分子機制實屬必要。

本研究基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)、GeneCards數據庫、OMIM數據庫、R軟件(v4.0.0)、perl軟件(v5.28.1)、UniProt數據庫、Cytoscape軟件(v3.7.0)、String在線軟件(v11.0)等研究工具，從分子水平探討淫羊藿治療GIOP的潛在藥物成分及機制，為后續藥物研發提供基礎。

1 材料和方法

1.1 篩選淫羊藿的活性成分

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP：http://http://tcmspw.com/tcmsp.php)是世界上最大的非商業中藥分子數據庫之一，收集了《中國藥典》中收錄的499味中草藥，包括3 311個靶點和29 384種成分[13]，形成了一個統一完整的中藥藥效學預測與驗證體系。口服生物利用度(OB)是口服藥物重要的藥代動力學性質之一，它對藥物進入體循環的效率起著重要的作用。類藥性(DL)是一個定性概念，旨在幫助優化藥物動力學和藥物特性。本研究確定淫羊藿的活性成分篩選標準為OB>30 %，DL>0.18。

1.2 將淫羊藿活性成分進行靶點預測，并對靶點添加基因名

利用TCMSP開發的靶點預測模型，進一步預測了淫羊藿活性成分的相關靶點，再通過perl軟件和UniProt (http://www.uniprot.org/) 數據庫對預測出的靶點進行添加基因名。

1.3 獲取GIOP的靶點基因

GeneCards[14]數據庫(https://www.genecards.org/)是一個將人類基因、編碼的蛋白質的功能以及所涉及的疾病整合為一體的數據庫。Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)數據庫[15](https://omim.org/)是有關基因和遺傳表型及其之間關系的數據庫。將“glucocorticoid induced osteoporosis”作為關鍵詞，通過GeneCards和OMIM兩個數據庫同時搜索GIOP的靶點基因，去除兩個數據庫中的重復結果，獲得GIOP疾病靶點基因。最后利用R軟件將淫羊藿靶點基因與GIOP靶點基因進行交集分析，并繪制出韋恩圖。

1.4 構建“淫羊藿-GIOP”調控網絡

運用perl軟件將淫羊藿靶點基因與“淫羊藿-GIOP”共同靶點基因一一映射，再將數據導入Cytoscape軟件進行可視化處理，得到“淫羊藿-GIOP”調控網絡。

1.5 構建淫羊藿治療GIOP的靶點基因蛋白互作(PPI)網絡

將“淫羊藿-GIOP”共同靶點基因數據導入String在線軟件(https://string-db.org/)，選擇種屬為“Homo sapiens”，設置最小互作得分為0.4，構建出PPI網絡，并導出相關數據。

1.6 篩選PPI網絡核心靶點基因

將1.5導出的PPI網絡數據利用R軟件進行計算，得到PPI網絡核心基因條圖。

1.7 GO和KEGG功能富集分析

為進一步闡述淫羊藿對GIOP的作用機制，將“淫羊藿-GIOP”共同靶點基因數據導入R軟件，進行GO功能富集分析和KEGG功能富集分析，并繪制出相關柱狀圖及氣泡圖。

2 結果

2.1 淫羊藿活性成分的篩選

通過TCMSP數據庫一共檢索到淫羊藿130個活性成分，再根據制定的篩選標準(OB>30 %，DL>0.18)進行篩選，得到淫羊藿23個主要活性成分，見表1。

表1 淫羊藿主要活性成分表Table 1 Main active components of herba epimedii

2.2 淫羊藿活性成分靶點預測

將篩選出的淫羊藿活性成分進行靶點預測后，再通過perl軟件和UniProt數據庫對預測出的靶點添加基因名，去除UniProt數據庫中檢索不到的靶點和重復靶點，最終獲得106個淫羊藿活性成分靶點。

2.3 獲取GIOP靶點基因與淫羊藿活性成分靶點取交集

通過GeneCards數據庫檢索，獲得1 519個GIOP相關靶點基因，通過OMIM數據庫檢索，得到185條GIOP疾病相關靶點，將兩個數據庫檢索結果合并后剔除重復靶點，最終獲得1 801個GIOP疾病靶點基因。再將其與淫羊藿活性成分靶點取交集，結果顯示(圖 1)“淫羊藿-GIOP”交集靶基因共有65個。

圖1 “淫羊藿-GIOP”交集靶基因Fig.1 Regulatory network diagram of herba epimedii-GIOP

2.4 “淫羊藿-GIOP”調控網絡構建

通過Cytoscape軟件將數據進行可視化處理，得到“淫羊藿-GIOP”調控網絡圖(圖 2)。圖中菱形表示GIOP，六邊形表示中藥淫羊藿，三角形表示淫羊藿的活性成分，橢圓形表示GIOP和淫羊藿的共同靶點基因。圖中顯示，淫羊藿主要通過20個活性成分作用于65個靶點基因來調控GIOP的疾病的發生。

圖2 “淫羊藿-GIOP”調控網絡圖Fig.2 Regulatory network diagram of herba epimedii-GIOP

2.5 淫羊藿治療GIOP的靶點基因的PPI網絡構建

運用String在線軟件構建出“淫羊藿-GIOP”共同靶點基因的PPI網絡(圖 3)，圖中顯示一共有64個節點，622條相互關系。通過各節點之間的相互關系，篩選出連接次數較多的5個靶點基因作為核心靶點基因(圖 4)，分別為白細胞介素-6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原激活蛋白激酶-8(MAPK8)、胱冬酶-3(CASP3)、雌激素受體-1(ESR1)。

圖3 “淫羊藿-GIOP”共同靶點基因PPI網絡Fig.3 PPI network of common target gene of herba epimedii-GIOP

圖4 核心靶點基因Fig.4 Core target genes

2.6 GO功能富集分析

將淫羊藿治療GIOP的核心靶點基因進行GO功能富集分析后得到如下柱狀圖(圖5)和氣泡圖(圖6)。圖中顯示，淫羊藿治療GIOP的核心靶點基因的GO功能主要包括核受體活性(nuclear receptor activity)、轉錄因子活性(transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、DNA結合轉錄劑活性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase II-specific)、類固醇結合(steroid binding)、RNA聚合酶II轉錄因子結合(RNA polymerase II transcription factor binding)、半胱氨酸型內肽酶活性與細胞凋亡的關系(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)、核激素受體結合(nuclear hormone receptor binding)、泛素樣蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、激素受體結合(hormone receptor binding)、泛素蛋白連接酶結合(ubiquitin protein ligase binding)、激活轉錄因子結合(activating transcription factor binding)、雌激素受體結合(estrogen receptor binding)、類固醇激素受體結合(steroid hormone receptor binding)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)、RNA聚合酶II基礎轉錄因子結合(RNA polymerase II basal transcription factor binding)等。由此可以推測出淫羊藿的活性成分主要通過調節以上生物功能來發揮其治療GIOP的功效。

圖5 GO柱狀圖Fig.5 GO bar plot

圖6 GO氣泡圖Fig.6 GO dot plot

柱狀圖和氣泡圖左側為GO名稱；柱狀圖下面的數字表示富集基因數目，氣泡圖下面的數字表示基因比例；氣泡圖中氣泡大小表示富集基因數目，氣泡越大，富集基因越多；柱狀圖和氣泡圖中的圖形均按P值著色，P值越小，顏色越紅，富集程度越高。

2.7 KEGG通路富集分析

將淫羊藿治療GIOP的核心靶點基因進行KEGG功能富集分析后得到如下柱狀圖(圖 7)和氣泡圖(圖 8)。圖中顯示，淫羊藿治療GIOP的核心靶點基因的KEGG通路主要有前列腺癌信號通路(prostate cancer)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、細胞凋亡信號通路(apoptosis)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙肝病毒信號通路(hepatitis B)、麻疹信號通路(measles)、結直腸癌信號通路(colorectal cancer)、人巨細胞病毒感染信號通路(human cytomegalovirus infection)、甲狀腺素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)等。由此可以推測出淫羊藿的活性成分有可能通過調節這些信號通路來發揮其治療GIOP的功效。

圖7 KEGG柱狀圖Fig.7 KEGG bar plot

圖8 KEGG氣泡圖Fig.8 KEGG dot plot

柱狀圖和氣泡圖左側為KEGG名稱；柱狀圖下面的數字表示富集基因數目，氣泡圖下面的數字表示基因比例；氣泡圖中氣泡大小表示富集基因數目，氣泡越大，富集基因越多；柱狀圖和氣泡圖中的圖形均按P值著色，P值越小，顏色越紅，富集程度越高。

3 討論

基于“疾病-基因-靶點-藥物”作用網絡，網絡藥理學技術整合了系統生物學、生物信息學等多學科研究藥物活性成分作用機制的新方法，通過系統分析藥物對疾病網絡的干預和影響，從活性成分、蛋白靶點等分子水平揭示藥物潛在作用機理，使得快速高效地探索中藥的多成分、多靶點、多途徑的作用機制成為可能。既往已有學者進行過淫羊藿治療骨質疏松癥[16]、絕經后骨質疏松癥[17]、激素性股骨頭壞死[18]的相關機制研究。而淫羊藿在GIOP的臨床治療中運用廣且療效佳，但對其相關機制研究的報道甚少，故筆者將其作為研究方向。

研究結果提示，淫羊藿可能通過多成分、多靶點、多通路影響GIOP的發病。淫羊藿治療GIOP的5個核心基因分別為白細胞介素-6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原激活蛋白激酶-8(MAPK8)、胱冬酶-3(CASP3)、雌激素受體-1(ESR1)。文娛等[19]在一項骨質疏松小鼠模型的實驗研究中發現，淫羊藿苷可以通過下調骨組織中IL-6的陽性表達，從而抑制骨質吸收，達到抗骨質疏松的作用。VEGFA是VEGF家族中的一種，VEGF可以通過增強成骨細胞中的堿性磷酸酶活性[20]，從而促進成骨細胞的增殖與分化，改善骨質。游利[21]通過細胞實驗發現，干預CASP3的表達可以增強堿性磷酸酶活性，誘導成骨相關基因的表達。雌激素在骨代謝的過程中發揮著重要作用[22]，研究[23]表明，骨細胞中的ERα可通過調節骨小梁的形成抑制骨質疏松。

研究發現，淫羊藿治療GIOP的相關分子機制主要集中在與細胞增殖分化、免疫和內分泌相關的3類途徑中，主要包括前列腺癌信號通路、細胞凋亡信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、TNF信號通路、糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路、乙肝病毒信號通路和麻疹信號通路等，提示淫羊藿可能通過這些信號通路來影響GIOP的發展。①前列腺癌信號通路：有研究者[24]對日本長期接受雄激素剝奪治療的前列腺癌患者進行調查，調查結果顯示接受雄激素剝奪治療6年后的前列腺癌患者，骨質疏松癥患病率達到45 %，而且隨著接受雄激素剝奪治療時間的延長，前列腺癌患者的骨質疏松患病率有統計學意義的增加，可見骨密度變化與前列腺癌及其治療方式有關。②細胞凋亡信號通路：細胞凋亡信號與GIOP的發病關系密切，Sato等[25]通過研究發現，GC通過誘導Pyk2磷酸化，促進成骨細胞和骨細胞凋亡，延長破骨細胞的壽命，導致骨吸收增加，從而引起GIOP的發病。③流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路：有研究[26]發現，在動脈粥樣硬化疾病的發病過程中，骨保護素通過參與調控血管因子發揮作用，而骨保護素同時也是參與骨代謝的重要蛋白，因此筆者推測骨保護素通過參與調控動脈粥樣硬化信號通路從而影響了GIOP的發病。④TNF信號通路：TNF-α因子可以通過加快骨質吸收、抑制骨質再生，在調節骨代謝的過程中發揮著重要作用[27]。⑤糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路：王寓平[28]通過實驗發現，AGEs/RAGE對內皮祖細胞轉化為成骨細胞具有積極作用，由此可以推測AGEs/RAGE信號通路與骨質疏松疾病的發展存在關系。⑥乙肝病毒信號通路：王三杏等[29]通過對1 033例體檢數據進行分析，發現骨質疏松患者的乙肝感染率明顯高于骨質正常者，提示骨質疏松與乙肝病毒可能存在一定關系。⑦麻疹信號通路：麻疹與GIOP發病機制的相關研究報道較少，有待進一步研究。

綜上所述，淫羊藿有可能是通過前列腺癌信號通路、細胞凋亡信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、TNF信號通路和糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路等多個途徑作用于白細胞介素-6、血管內皮生長因子A、絲裂原激活蛋白激酶-8、胱冬酶-3和雌激素受體-1等靶點參與調節骨形成和破骨吸收之間的平衡，從而達到防治GIOP的作用。此次基于多個數據庫運用網絡藥理學方法對淫羊藿治療GIOP的分子機制研究，為后期的藥效機制研究提供了新的思路和方向。由于網絡藥理學方法所涉及的數據庫及軟件算法等多方面有著一定的局限性，因此為取得更加可靠的研究結果，還需進一步通過實驗驗證。