基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柚皮苷治療骨質(zhì)疏松癥的潛在機(jī)制

張鵬 余翔 陳卓峰 任輝 沈耿楊 張志達(dá) 尚奇 梁德 江曉兵,4*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510405 3.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 523808 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種系統(tǒng)性骨病，常引起骨折等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。OP在中醫(yī)學(xué)里面屬于“骨痿”等范疇，其主要病機(jī)為腎精不足，骨失滋養(yǎng)[2]。以脊柱變形、全身骨骼疼痛、易出現(xiàn)骨折為主要臨床表現(xiàn)[3]。OP與年齡密切相關(guān)[4-5]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年我國60歲以上的老年人中超過三分之一患有OP，其中男性約占25 %，女性接近50 %[6]，OP危害老年人的生命健康，增添家庭、社會(huì)的負(fù)擔(dān)。抑制骨吸收藥物是臨床治療OP的主要藥物[7]，但這些藥物因使用過程中存在一些并發(fā)癥從而限制了其臨床運(yùn)用[8]。目前，中醫(yī)藥治療OP的療效逐漸被患者所認(rèn)可，引起了當(dāng)今國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[9-10]。

作為骨碎補(bǔ)中含量最豐富的一種黃酮類活性分子，柚皮苷(naringin，NR)具備補(bǔ)腎強(qiáng)骨等療效[11]，在臨床上有較好的實(shí)際運(yùn)用和發(fā)展前景。目前研究顯示NR能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖[12]，也可通過誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化[13]。但是，NR治療OP涉及靶點(diǎn)通路眾多，起效機(jī)制復(fù)雜，傳統(tǒng)藥理學(xué)難以進(jìn)行系統(tǒng)的分析。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的新興和發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為研究潛在分子機(jī)制的新方法，更系統(tǒng)綜合地分析活性分子對(duì)疾病治療的起效機(jī)制，與活性分子多靶點(diǎn)、多途徑干預(yù)疾病的治療原理相契合[14]。本文擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究NR治療OP的潛在作用機(jī)制，為其提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 獲取NR結(jié)構(gòu)及靶點(diǎn)信息

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)獲取NR結(jié)構(gòu)及其靶點(diǎn)信息，同時(shí)通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取NR的三維結(jié)構(gòu)(以SDF格式儲(chǔ)存)，并將所得到的NR三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://new.swisstargetprediction.ch/)獲得NR的相關(guān)靶點(diǎn)，然后將TCMSP數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)去重合并得到NR的靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的人源基因名。

1.2 OP靶點(diǎn)集的獲取及NR治療OP的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

檢索GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org)數(shù)據(jù)庫獲得OP對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。利用R軟件，將OP靶點(diǎn)與 1.1 中靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到兩者交集靶點(diǎn)。

1.3 建立NR治療OP的靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

在STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，隱藏孤立蛋白后得到蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)信息，并將其輸入到Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件建立PPI網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，將網(wǎng)絡(luò)中高于度值(degree)平均值的靶點(diǎn)蛋白篩選出來作為核心靶點(diǎn)。

1.4 NR治療OP網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

建立柚皮苷交集靶點(diǎn)與骨質(zhì)疏松的對(duì)應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2 軟件中繪制NR治療OP網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO功能富集分析

使用 R 軟件及其程序包對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，pvalue Cutoff、qvalue Cutoff均設(shè)為0.05，將每類顯著性排在前20的富集結(jié)果以點(diǎn)狀圖的形式進(jìn)行展示。此外，將交集靶點(diǎn)輸入至 Cytoscape 3.7.2 軟件中進(jìn)行GO功能富集分析，將主要與疾病相關(guān)的生物學(xué)過程或功能篩選出來(P< 0.05)，最后將交集靶點(diǎn)及上述生物學(xué)過程或功能進(jìn)行可視化展示。

1.6 KEGG通路富集分析

同樣通過 R 軟件及其程序包對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行 KEGG分析，pvalue Cutoff、qvalue Cutoff均設(shè)為0.05，按照顯著性進(jìn)行排序，將富集得到的信號(hào)通路(P< 0.05)進(jìn)行展示，并運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件繪制NR治療OP的“通路-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 NR結(jié)構(gòu)及其靶點(diǎn)信息

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索去重后得到105個(gè)作用靶點(diǎn)。NR結(jié)構(gòu)相關(guān)信息詳見表 1，105個(gè)作用靶點(diǎn)詳見表 2。

表1 柚皮苷的結(jié)構(gòu)Table 1 The structure of naringin

2.2 NR治療OP的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

共獲得OP相關(guān)靶點(diǎn) 3 261個(gè)，與2.1中得到的105個(gè)NR靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到交集靶點(diǎn) 44個(gè)，見圖1。NR治療OP的潛在作用靶點(diǎn)見表3。

圖1 柚皮苷-骨質(zhì)疏松癥交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of naringin-osteoporosis intersection targets

表3 柚皮苷治療骨質(zhì)疏松潛在作用靶點(diǎn)基因

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

將STRING 數(shù)據(jù)庫得到的PPI信息輸入到 Cytoscape 3.7.2 軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共涉及41個(gè)節(jié)點(diǎn)，161條邊，詳見圖2。 該網(wǎng)絡(luò)中超過度值平均值(7.85)的靶點(diǎn)蛋白有18個(gè)，視其為核心靶點(diǎn)，意味著它們很有可能是NR對(duì)OP起治療作用的關(guān)鍵。核心靶點(diǎn)信息詳見表4。

圖2 潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of potential targets

表4 柚皮苷治療骨質(zhì)疏松網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)

2.4 NR治療OP網(wǎng)絡(luò)圖

構(gòu)建“柚皮苷-交集靶點(diǎn)-骨質(zhì)疏松”的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將其輸入 Cytoscape 3.7.2 軟件中，得到NR治療OP網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)由46個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中 1 個(gè)NR節(jié)點(diǎn)，44個(gè)靶點(diǎn)，1 個(gè)OP節(jié)點(diǎn))和88條邊組成。網(wǎng)絡(luò)圖中藍(lán)色菱形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，紅色多邊形節(jié)點(diǎn)代表“柚皮苷”，橙色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表“骨質(zhì)疏松癥”，線條代表柚皮苷、骨質(zhì)疏松癥與靶點(diǎn)具有對(duì)應(yīng)關(guān)系，見圖3。

圖3 柚皮苷-交集靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Naringin-intersection target-osteoporosis network diagram

2.5 GO功能富集分析

使用R軟件進(jìn)行GO生物過程(GO BP)富集分析，共獲得533個(gè)結(jié)果，主要涉及類固醇激素反應(yīng)、固有凋亡信號(hào)通路、激素分解代謝過程、腺體發(fā)育、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等；GO細(xì)胞組成(GO CC)富集分析共獲得3個(gè)結(jié)果，涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)；GO分子功能(GO MF)富集分析共獲得71個(gè)結(jié)果，主要涉及雌激素受體結(jié)合、肽鏈內(nèi)切酶、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核受體、轉(zhuǎn)錄因子的活性等方面。GO BP、GO CC、GO MF富集分析結(jié)果見圖4～圖6。此外，將 44個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2 進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果主要涉及①炎癥相關(guān)的，如調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等；②細(xì)胞周期相關(guān)的，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡；③激素代謝相關(guān)的，如雄激素代謝過程，雌激素受體結(jié)合等。詳見圖7。

圖4 GO BP富集分析結(jié)果Fig.4 GO BP enrichment analysis results

圖5 GO CC富集分析結(jié)果Fig.5 GO CC enrichment analysis results

圖6 GO MF富集分析結(jié)果Fig.6 GO MF enrichment analysis results

圖7 篩選后的GO富集分析圖Fig.7 GO enrichment analysis after screening

2.6 KEGG分析

使用R軟件對(duì)44個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析。共得到 43個(gè)結(jié)果，相關(guān)信號(hào)通路共有11條，詳見表5，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，詳見圖8，圖中粉紅色三角形節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，藍(lán)色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表基因，線條代表通路與基因之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3 討論

3.1 靶標(biāo)與PPI網(wǎng)絡(luò)分析

柚皮苷是中藥骨碎補(bǔ)中活性成分含量最豐富的一類黃酮類化合物，同時(shí)也存在于柑橘類水果和許多中藥里面[15]?，F(xiàn)有研究表明黃酮類化合物可通過雌激素受體介導(dǎo)、OPG/RANK/RANKL、酶抑制作用、調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等機(jī)制預(yù)防OP[16]。

表5 KEGG通路富集結(jié)果Table 5 KEGG pathway enrichment analysis results

圖8 “通路-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Pathway-target network

通過靶點(diǎn)預(yù)測得到柚皮苷作用于骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)共44個(gè)，經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選后的核心靶標(biāo)共有18個(gè)，主要有 TNF、CASP3、ESR1、CDKN1A等，PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征以炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及激素代謝相關(guān)的蛋白居多，與GO富集分析結(jié)果相互印證。其中TNF的度值遠(yuǎn)高于其他核心靶點(diǎn)，推測TNF是柚皮苷治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TNF(腫瘤壞死因子)，通稱為TNF-α，是一種炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要因子，可誘導(dǎo)巨細(xì)胞集落刺激因子(macro-phagecolony-stimulating factor，M-CSF)的表達(dá)，可通過激活NF-kB啟動(dòng)RANKL(NF-κB受體激活因子配體)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，加速骨吸收發(fā)展進(jìn)程，為骨質(zhì)疏松癥的上調(diào)基因[17-18]。因此，筆者推測柚皮苷可以通過下調(diào)骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)TNF-α水平，下調(diào)RANKL的表達(dá)，減少破骨細(xì)胞的生成，起到防治OP的目的。CASP3(半胱氨酸蛋白酶3)是度值排列第二的靶標(biāo)，影響細(xì)胞凋亡過程[19]。有研究通過實(shí)驗(yàn)證明CASP3 mRNA表達(dá)上調(diào)對(duì)治療OP有促進(jìn)作用[20]。進(jìn)一步的研究表明CASP3的上調(diào)可以激活p53信號(hào)通路破壞成骨細(xì)胞成熟并抑制軟骨細(xì)胞分化[21]。ESR1(雌激素受體)是度值排列第三的靶標(biāo)，與骨形成代謝等具有密切關(guān)系，ESR1與雌激素結(jié)合后，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，影響相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)控軟骨內(nèi)成骨的過程，對(duì)軟骨厚度的維持、骨生長平衡有促進(jìn)作用[22]。絕經(jīng)后婦女出現(xiàn)骨質(zhì)疏松是由于體內(nèi)缺乏雌激素，致使骨量丟失加速，甚至引發(fā)骨折，而ESR1是雌激素在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理活性的作用靶點(diǎn)，主要表現(xiàn)在細(xì)胞的生長分化、衰老凋亡，由此可見ESR1與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松密切相關(guān)[23]。CDKN1A(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1 A)，又稱為p21，能夠調(diào)控細(xì)胞的增值、分化和衰老[24]。成骨細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[25]，而細(xì)胞增殖周期的進(jìn)程主要受到G1期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控[26]。CDKN1A(p21)，作為G1期調(diào)節(jié)蛋白，能結(jié)合細(xì)胞周期素與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶形成的復(fù)合體，使其失活[27]，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G1期[28]。吳銀生等[29]研究發(fā)現(xiàn)，第3腰椎成骨細(xì)胞p21蛋白含量在大鼠去卵巢4、8、12、18、24周顯著升高(P<0. 01)。易顯富等[30]研究發(fā)現(xiàn)p21蛋白表達(dá)的下調(diào)可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。劉明等[31]研究發(fā)現(xiàn)，新仙靈骨葆膠囊可能通過作用于p21等G1期關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白而影響成骨細(xì)胞增殖周期，可治療大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松癥?？梢?，CDKN1A在成骨細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

此外，表3中PTGS1(COX-1)是限制前列腺素生成的一類酶，而前列腺素可以誘導(dǎo)M-CSF以及RANKL的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞功能[18]。ESR2與ESR1同為雌激素的受體，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相關(guān)。

故柚皮苷-交集靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松網(wǎng)絡(luò)圖關(guān)聯(lián)復(fù)雜，可見柚皮苷治療骨質(zhì)疏松是通過多靶點(diǎn)多途徑之間的相互作用實(shí)現(xiàn)的，并且蘊(yùn)含著多種潛在的治療作用。

3.2 GO分析和KEGG分析

GO富集分析結(jié)果所反映的內(nèi)容與PPI網(wǎng)絡(luò)規(guī)律相似，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及激素代謝相關(guān)。而KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示相關(guān)靶點(diǎn)基因富集于p53、IL-17、NF-κB、Estrogen、Prolactin等信號(hào)通路，可能是柚皮苷治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵信號(hào)通路，KEGG通路富集分析結(jié)果反映的內(nèi)容也與PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析及GO富集分析結(jié)果規(guī)律相似。相關(guān)研究表明，p53信號(hào)通路的激活能破壞成骨細(xì)胞成熟并抑制軟骨細(xì)胞分化[21]。IL-17信號(hào)通路能夠通過IL-17刺激單核細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞，且IL-17可以促進(jìn)TNF-α的合成，上調(diào)IL-6、NF-κB等細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成[32]。破骨細(xì)胞的激活依賴于RANKL與RANK的結(jié)合，進(jìn)而活化NF-kB信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化[33]，通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路，能夠抑制破骨細(xì)胞分化。由此可見IL-17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路與OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的機(jī)制密切相關(guān)。據(jù)此推測IL-17信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路可能是柚皮苷治療骨質(zhì)疏松癥的重要信號(hào)通路。Estrogen(雌激素)信號(hào)通路可以匯聚Wnt信號(hào)通路、蛋白激酶通路、BMP-2信號(hào)通路等共同調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[34]。此外Prolactin(泌乳素)信號(hào)通路同Estrogen(雌激素)信號(hào)通路均表明柚皮苷具有雌激素調(diào)節(jié)作用，是柚皮苷可運(yùn)用于絕經(jīng)后OP的證據(jù)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示柚皮苷可能通過多靶點(diǎn)、多通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期、激素代謝來治療骨質(zhì)疏松。本研究所得結(jié)果與現(xiàn)有的骨質(zhì)疏松研究結(jié)果相吻合，為后續(xù)的柚皮苷藥理機(jī)制分析和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了數(shù)據(jù)支持。