棠梨果實中綠原酸提取工藝的優化及抗氧化作用

廣東省科學院，廣東省測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室（廣州 510070）

棠梨（Pyrus calleryanaDecne）別名杜梨、海棠梨、野梨子，是薔薇科梨屬植物[1]，分布于我國云南、四川、貴州和甘肅等省，長在海拔1 000～1 500 m的高山喜光林中或灌木草原上。我國對于棠梨的應用具有悠久的歷史，棠梨味酸、甘、澀、性寒，可全株入藥，其果實具有潤腸通便、消腫止痛、斂肺澀腸以及止咳止痢之效。其根和葉入藥可潤肺止咳、清熱解毒，主要用于治療干燥咳嗽、急性眼結膜炎等癥[2-4]，在古代多被用于疏肝和胃、緩急止瀉。棠梨具有良好的藥用和保健功能，在食品、保健品和醫藥行業有著良好的應用前景[5-6]。

目前對于棠梨的相關研究較少，其果實具有一定的藥用效果，棠梨果實中綠原酸含量較高，具有一定的開發價值。綠原酸由咖啡酸和奎尼酸縮合而成，具有一定的抗氧化[7]、抗癌[8]、降脂和降血壓[9-10]等作用。此次試驗采用甲醇進行提取，在單因素的基礎上，利用響應面優化法，對棠梨果實中綠原酸進行提取工藝的優化。為棠梨果實的開發與利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棠梨果實（產地江西，樣品干燥至恒質量，備用）；綠原酸標準品、蘆丁標準品、抗壞血酸（中國食品藥品檢定研究院）；1,1-2苯基-2-三硝基苯肼、無水甲醇（AR，廣州試劑廠）。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外可見光分光光度計（日本島津公司）；Sartorius電子天平（BSA224S，廣州市深華實驗儀器設備有限公司）；搖擺式中藥粉碎機（上海頂帥電氣公司）；KQ2200B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科貿有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠原酸的提取

精密稱取1.0 g粉碎均勻的棠梨果實于離心管中，加入一定體積的甲醇溶液，置于超聲波清洗儀中進行提取，設定超聲時間與溫度。待提取液冷卻后真空抽濾，將濾液定容至100 mL，將其過0.22 μm針孔過濾器，待測。

1.3.2 綠原酸標準曲線的測定

吸取106.5 μg/mL綠原酸標準溶液于100 mL比色管中，配制成質量濃度依次為0.0，4.26，8.52，12.78，17.04，21.30和25.56 μg/mL綠原酸標準品待測溶液。以零管為空白，在波長328 nm處測定標準溶液的吸光度。以綠原酸標準溶液的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制綠原酸標準曲線，得到回歸方程A=0.051 8C+0.003 000，相關系數R=0.999 9。棠梨果實樣品中綠原酸含量根據標準曲線回歸方程算得，提取率按式（1）計算。

式中：C為樣品中綠原酸含量，μg/mL；V為定容體積，mL；W為稱樣量，g。

1.3.3 單因素試驗設計

精密稱取1.0 g粉碎后的棠梨果實，以綠原酸的提取率為指標，研究甲醇體積分數（40%，50%，60%，70%和80%）、提取溫度（30，40，50，60和70 ℃）、提取時間（10，20，30，40和50 min）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）對棠梨果實中綠原酸提取率的影響。

1.3.4 因素水平設計

以單因素試驗結果為基礎，選擇對棠梨果實中綠原酸提取率有影響的4個因素，采用響應面優化法中的Box-Behnken設計進行優化試驗。以甲醇體積分數（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）和料液比（D）為自變量，綠原酸的提取率為響應值進行試驗設計，因素水平設計如表1所示。

表1 響應面分析因素水平

1.3.5 棠梨果實中綠原酸、抗壞血酸、蘆丁抗氧化能力的測定[11-12]

準確稱取23.8 mg DPPH試劑，用70%的甲醇溶液配制成6.0×10-5mol/L DPPH溶液，作為母液于冰箱冷藏備用。吸取10 mL DPPH母液，用70%甲醇定容至100 mL，作為DPPH自由基測定的反應試劑。取2 mL不同濃度樣品液，與2 mL DPPH溶液混合，避光反應30 min，在517 nm波長下測定吸光度A1，用2 mL 70%甲醇代替樣品液測得吸光度A0，抗壞血酸作為陽性對照。平行操作重復3次，清除率按式（2）計算。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 甲醇體積分數和提取溫度對含量的影響

由圖1（a）可知，隨著甲醇體積分數增加，綠原酸提取率逐漸增大，當體積分數為70%時綠原酸提取率達到最大，隨后降低。這是由于綠原酸的分子結構中含多個羥基和羧基的大極性基團。在一般情況下，甲醇體積分數越低，溶解性越差，綠原酸提取率越少。隨著溶劑體積分數的增高，提取率逐漸增大，但溶劑體積分數過高，可以使一些醇溶性雜質、色素等溶出量增大，導致綠原酸提取效果不佳，所以才會出現先升高后降低的現象。因此，棠梨果實綠原酸提取較適宜的甲醇體積分數為70%。由圖1（b）可知，隨著溫度的升高，綠原酸的提取率逐漸增大，當提取溫度為60 ℃時提取率達到最大，繼續升溫則會有所降低。因為溫度過高會導致綠原酸中的酚羥基和羧基被破壞，形成新的物質，導致提取率降低。

圖1 甲醇體積分數與提取溫度對綠原酸提取率的影響

2.1.2 提取時間和料液比對綠原酸提取率的影響

由圖2（a）可知，棠梨果實中綠原酸的提取率隨著提取時間的延長呈現先上升后下降的現象，提取時間30 min時綠原酸含量最高。可能過長的提取時間使部分綠原酸結構被破壞，從而導致綠原酸含量降低。因此，選擇30 min為提取時間。由圖2（b）可知，不同料液比對綠原酸提取率影響相對較大。隨著料液比的增大，綠原酸含量逐漸增大，當料液比為1∶30（g/mL）時，綠原酸提取率達到最大，而后達到一個穩定作用。因此，棠梨果實綠原酸提取率較適宜的料液比為1∶30（g/mL）。

圖2 提取時間與料液比對綠原酸提取率的影響

2.2 響應面優化提取條件

2.2.1 響應面試驗結果及分析

根據表1中響應面試驗方案，設計試驗及試驗結果見表2，方差分析見表3。

根據Design-Expert 7.0軟件的分析結果可知，該模型p值小于0.000 1，表明模型擬合成功。對綠原酸的提取率采用二次多項式模型分別進行擬合，其方程為

Y提取率=1.26-0.013A-0.026B+0.059C-0.078D+2.750×10-3AB-7.500×10-4AC-0.038AD+1.000×10-3BC+0.036BD+0.044CD-0.15A2-0.13B2-0.041C2-0.084D2（R2=0.990 7）

擬合方程相關性R＞0.9，其擬合度良好，可用于棠梨果實中綠原酸提取率的優化。

2.2.2 響應面交互作用分析

采用Design-Expert 7.0軟件對所得試驗進行響應曲面分析，得出兩兩因素之間對棠梨果實中綠原酸提取率的影響，結果如圖3所示。

由圖3和表3中各因素p值可知，提取溫度、提取時間和料液比影響顯著。通過Design-Expert 7.0軟件的分析，最優提取條件為甲醇體積分數70.0%，提取溫度58.5 ℃，提取時間45.2 min，料液比1∶26.4（g/mL）；在該條件下，綠原酸的提取率為1.294%。為方便實際操作，修正最優條件為甲醇體積分數70%，提取溫度58 ℃，提取時間45 min，料液比1∶26（g/mL）。

表2 試驗方案及結果

表3 棠梨果實中綠原酸提取率的回歸方程方差分析

圖3 兩兩因素交互對棠梨果實中綠原酸提取率提取量的影響

2.2.3 最佳條件驗證

由圖4和表4可知，棠梨果實中綠原酸、VC、蘆丁均具有較強的DPPH自由基清除能力，且清除能力隨著抗氧化樣品溶液濃度的增大而增強。

按2.2.2的最優試驗條件，進行6次平行驗證試驗，測得綠原酸的提取率平均值為1.278%，與預測值接近，且RSD為1.110%，表明響應面分析所得的理論最佳提取條件準確可靠。

表4 VC、綠原酸和蘆丁回歸方程與IC50值

圖4 VC、綠原酸和蘆丁對DPPH自由基的清除作用

2.3 金銀花綠原酸提取物的抗氧化能力評價

通過比較三者的半數清除率IC50可知，棠梨果實綠原酸抗氧化能力略強于VC，蘆丁相比綠原酸及VC，抗氧化能力較差。

3 結論

以棠梨果實中綠原酸的提取率為指標，探討了不同甲醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度對綠原酸提取率的影響。在單因素試驗的基礎上，以甲醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度為影響因素，應用Box-Behnken響應面優化試驗設計，以綠原酸的回收率為響應值，進行響應面分析，確定了最佳試驗條件：甲醇體積分數70%，提取溫度58 ℃，提取時間45 min，料液比1∶26（g/mL）。該條件下綠原酸的提取率達到最大。試驗還考察了棠梨果實中綠原酸的抗氧化活性，其DPPH自由基的半數清除率為0.935 μg/mL，具有較好的抗氧化活性。因此，此次研究結果對棠梨的綜合開發利用具有一定的參考價值。