液態法發酵燕麥酒工藝優化

李建芳，李飛，陳龍，曲艷，周楓

信陽農林學院食品學院（信陽 464000）

燕麥屬于禾本科一年生草本植物，喜冷涼濕潤，生長期長，但是產量較低。在我國，燕麥主要用于家畜飼料與部分食糧[1]。燕麥營養價值較高，它的蛋白質含量12%～18%，脂肪4%～6%，淀粉21%～55%，籽實中維生素B1、鈣和膳食纖維尤其豐富[2]，是谷物中較好的一種。燕麥具有抗氧化[3]、調節血糖血脂[4]、抗疲勞[5]的作用。燕麥中含有的β-葡聚糖在日常飲食中扮演著減少糖尿病并發癥的角色[6]。燕麥還常作為輔料加入乳品或飲品中。

黃酒是我國眾多酒中最為古老的一種飲料酒。它是以谷物為原料，通過多種酶與微生物的共同作用發酵而成的酒類[7]。黃酒的營養成分為低分子糖類、肽、氨基酸等浸出物，易被人體消化和吸收；其糖分能夠直接吸收到血液中，產生能量；黃酒酒液中含有的經微生物作用過的活化水在80%～85%；黃酒中含有豐富維生素與微量元素。正是由于這些成分，黃酒具有增加食欲、恢復機能、幫助消化、促進血液循環的作用[8]。

試驗大多用酒曲進行燕麥黃酒發酵。戴銘成[9]以炒制燕麥為原料，加入酒曲發酵釀制成燕麥黃酒，但燕麥粒與酒曲作用時間較長，發酵效率較低。羅文華等[10]通過粉碎、過篩并將其蒸熟的步驟，但相較于液態發酵，相同時間下發酵效果較差，發酵水平較弱。劉浩等[11]分析液態燕麥黃酒中液化、糖化、發酵的最佳因素，由于缺少糖化、發酵2個步驟的工藝研究，并不能確定試驗是否達到最優效果。

試驗以燕麥米為原料，將其隔水蒸熟后進行先糖化后發酵的液態發酵，通過單因素和正交試驗對糖化、主發酵工藝進行優化，用理化指標評判發酵燕麥黃酒的品質，確定出最為適宜的糖化發酵條件，以期降低原料處理的時間與難度，擴展燕麥黃酒的液態發酵應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

燕麥（市售，產地為河北張家口）；耐高溫α-淀粉酶（30 U/mg，食品級，河南萬邦實業有限公司）；糖化酶（食品級，北京鑫達食品添加劑有限公司）；檸檬酸（食品級，河南雙騰實業有限公司）；活性干酵母（丹寶利酵母有限公司）；酒石酸鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、硫酸銅、亞甲基藍（均為分析純，天津市巴斯夫化工有限公司）。

1.1.2 設備與儀器

孔徑0.425 mm分樣篩（上虞市五四食材儀器）；數顯恒溫水浴鍋（HH-1型，上海梅香儀器有限公司）；生化培養箱（SHP型，上海山連實驗設備有限公司）；電子萬用爐（DL-1型，北京市永光明醫療儀器有限公司）；分析天平（FA2104型，上海良平儀器儀表有限公司）；恒溫鼓風干燥箱（101-3型，北京市科偉永興儀器有限公司）；雙環火電磁爐（JYC-21HEC05型，杭州九陽生活電器有限公司）；雙層蒸鍋（BDY-Z613B型，德世朗廚具（上海）有限公司）、手持糖度計（WYT型，上海滬粵明科學儀器有限公司）；料理機（JYL-C012E型，九陽股份有限公司）；廚房秤（CFC001型，千團精工廚具（浙江）有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酒液化發酵工藝流程及操作要點

工藝流程：

操作要點：

1) 粉碎。燕麥通過料理機打碎，過孔徑0.425 mm的網篩，置于塑封袋中儲存。

2) 蒸煮。取20 g燕麥粉于250 mL錐形瓶中，隔水蒸30 min，將蒸好的燕麥冷卻至30～37 ℃。

3) 液化。將蒸好的燕麥粉調整料水比1∶3.5 g/mL后加入5 U/g耐高溫α-淀粉酶，放置在95 ℃水浴爐中液化40 min，在液化的同時進行攪拌。

4) 糖化。將完成液化的燕麥粉進行降溫，在約65 ℃時用10%檸檬酸溶液調節至pH 4，加入糖化酶，在65 ℃下采用恒溫浸出糖化法[12]糖化。

5) 發酵。將干酵母置于其體積的10～20倍的35～40 ℃溫水中，活化20 min，再將糖化處理好的錐形瓶中加入等量無菌水，倒入活化好的酵母菌液，進行封口，置于發酵箱中進行發酵。

6) 抽濾。取發酵好的產物的上清液進行減壓過濾，保留濾液。

7) 沉淀。將所得的濾液進行封口處理，在室溫下靜置1 d后利用紗布進行再次過濾。

8) 殺菌。將二次過濾后的濾液在72～75 ℃下處理15～240 s，進行巴氏殺菌（HTST）。

1.2.2 糖化發酵單因素試驗設計

1.2.2.1 糖化酶添加量的影響

以20 g燕麥粉為原料，糖化溫度65 ℃，糖化時間180 min進行糖化，分別添加0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%糖化酶，取2 mL稀釋50倍后測定其還原糖度。

1.2.2.2 糖化時間的影響

以20 g燕粉麥為原料，糖化溫度65 ℃，加酶量為0.3%進行糖化，分別以45，90，135，180和225 min進行糖化。取2 mL糖漿稀釋50倍后滴定其還原糖度。

1.2.2.3 酵母添加量的影響

以20 g燕麥粉為原料，根據最佳的糖化工藝，加入與樣品體積3.5倍無菌水，27 ℃溫度下恒溫發酵6 d，加菌量0.5%，0.7%，0.9%，1.1%和1.3%進行發酵，取濾液測定其可溶性固形物含量及pH。

1.2.2.4 發酵溫度的影響

以20 g燕麥粉為原料，根據最佳糖化工藝，加入0.9%酵母菌，并添加為樣品3.5倍的無菌水，分別以21，24，27，30和33 ℃下對其進行發酵6 d，取濾液測定其可溶性固形物含量及pH。

1.2.2.5 發酵時間的影響

以20 g燕麥粉為原料，使用最佳糖化工藝，在加菌量0.9%，27 ℃下，加水量為樣品3.5倍的情況下分別發酵2，4，6，8和10 d，取濾液測定其可溶性固形物含量及pH。

1.3 糖化發酵正交試驗

根據單因素所得結果確定最佳水平范圍，使用L27(35)正交表，以感官評分為考察指標，設計五因素三水平的正交試驗（表1）確定最佳糖化發酵工藝條件。

表1 正交試驗表

1.4 感官評分方法

采用計分品評法，滿分為100分。由20名生產專業人員從燕麥黃酒的色澤、香味、口感和酒體風格對液態法發酵的燕麥黃酒進行感官品評。針對液態發酵工藝所得出的燕麥黃酒的感官評價標準見表2。

1.5 理化指標測定方法

1.5.1 還原糖的測定

采用直接滴定法[14]，同法平行操作3份，取其平均值。每組的還原糖測定試驗均重復3次，取其平均值。

1.5.2 可溶性固形物含量的測定

采用手持糖度計直接測量，對結果進行1位估讀。重復平行試驗10次，取其平均值。

1.5.3 pH測定

采用pH計在用pH 4緩沖溶液校準后直接測量，重復平行5次，取其平均值。

1.5.4 酒精度、總糖、總酸、微生物含量的測定

按照GB/T 13662—2018《黃酒》中的測定方法執行。

1.6 數據處理

獲得的數據通過Excel 2010進行計算，正交試驗結果的方差分析與極差分析通過Matlab軟件進行。

表2 燕麥黃酒評分標準表

2 結果與分析

2.1 糖化酶添加量對糖化工藝的影響

糖化酶添加量對糖化效果的影響見圖1。糖化酶添加量小于0.3%時，糖化酶添加量與糖化度成正相關關系；糖化酶添加量大于0.3%時，糖化度變化不大；糖化酶添加量0.5%時，與糖化酶添加量0.4%相比，糖化度略有下降但沒有明顯差異。綜合進行考慮，選擇0.2%，0.3%和0.4%較優糖化酶添加量。

圖1 糖化酶添加量對糖化工藝的影響

2.2 糖化時間對糖化的影響

糖化時間對糖化度的影響見圖2。0～180 min時，隨著糖化時間延長，糖化度顯著增大，在180 min后基本達到穩定。為保證糖化質量，選擇135，180和225 min作為較優糖化時間。

2.3 酵母添加量對發酵工藝的影響

燕麥中蛋白質和脂肪含量高于常見的釀酒原料，較常見酒相比，燕麥黃酒發酵過程中蛋白質分解成小分子可溶性物質[15]，脂肪轉化為酸。因此，在發酵過程中燕麥黃酒的可溶性固形物含量增加。

如圖3所示，酵母添加量小于0.9%時，隨著酵母添加量增加，可溶性固形物含量提高，酵母添加量大于0.9%后變化不大，趨于平緩。此時燕麥中的糖分發酵完畢，酵母的增加將不會影響可溶性固形物。

酵母添加量0.5%～0.7%時，pH不斷下降，此時酵母菌依舊處于有氧呼吸而大量繁殖階段，酵母添加量0.9%時，pH無下降趨勢并基本達到穩定。故選擇0.7%，0.9%和1.1%為較優酵母添加量。

圖2 糖化時間對糖化的影響

圖3 酵母添加量對發酵結果的影響

2.4 發酵溫度對發酵工藝的影響

由圖4可知，發酵溫度不同，釀酒酵母的活性隨之改變。起始階段由于酵母菌代謝能力逐漸加強，糖類利用逐漸增多，可溶性固形物含量由高到低變化，發酵溫度27 ℃時最終趨于穩定，燕麥中糖類物質基本使用完畢。發酵溫度33 ℃時，可溶性固形物含量上升，此時發酵溫度超過酵母最適溫度，發酵速率下降。

pH在起始階段同樣不斷降低，但在27 ℃時出現上升趨勢，該溫度下酵母菌代謝速率表現加快，但從后2組數據來看并未達到峰值。溫度30 ℃時pH趨于穩定，與33 ℃相比變化不大。兼顧成本考慮，選擇27，30和33 ℃為較優發酵溫度。

2.5 發酵時間對發酵工藝的影響

由圖5所示，隨著發酵時間延長，由于酵母菌的利用，燕麥米中的蛋白質與脂肪轉化增多，酒中可溶性固形物含量增加，發酵時間6 d時，基本達到穩定，即可溶性固形物基本不再產生。發酵時間10 d時，固形物含量降低，此時酵母的酒精發酵轉為乳酸發酵，持續利用糖類，黃酒品質下降。

起先由于酵母菌大量繁殖，pH先降低，隨后由于代謝pH增加，在6 d后基本達到穩定。故選擇4，6和8 d為較優發酵時間。

圖4 發酵溫度對發酵結果的影響

圖5 發酵時間對發酵結果的影響

2.6 糖化與主發酵工藝正交試驗結果

根據單因素試驗所得的合適水平范圍，使用L27(35)正交表，以感官評分作為評價指標確定最佳的發酵-糖化組合（見表3），正交試驗及其感官評分結果如表3所示。對其進行極差分析（見表4）與方差分析（見表5）。

糖化酶量、發酵時間對燕麥黃酒的感官均有顯著影響（p＜0.05），其中糖化酶量達到極顯著水平（p＜0.01），影響大小的順序為糖化酶添加量＞發酵時間＞酵母添加量＞糖化時間＞發酵溫度，綜合分析得到最佳條件組合為A2B2C3D2E1，即糖化酶添加量0.3%、糖化時間180 min、酵母添加量1.1%、發酵溫度30 ℃、發酵時間4 d的組合具有最好的感官評分。但是該組合并未出現在正交試驗中。出現在正交試驗中評分最高的組合為13，即糖化酶添加量0.3%、糖化時間180 min、酵母添加量1.1%、發酵溫度27 ℃、發酵時間4 d的組合，感官分數為78分。故對兩者進行對比。通過對過濾后的酒的色香味進行對比感官評價，認為組合A2B2C3D2E1更佳。

表3 正交試驗結果表

表4 正交試驗極差分析

表5 正交試驗方差分析

2.7 最佳釀造工藝下燕麥黃酒的品質

通過最佳釀造工藝所得的產品呈米黃色，清亮透明，溫和爽口，有明顯燕麥香氣，且回味有燕麥味。具體品質指標測定結果如表6。在最佳工藝下，各項理化指標均符合國家標準。

表6 產品品質理化指標對照表

3 結果、結論與討論

3.1 結果

3.1.1 糖化結果

糖化酶添加量0.3%時，糖化度基本保持不變。此時燕麥粉中的淀粉基本被糖化，正交試驗結果也有所體現。故確定0.3%為最優糖化酶添加量。

單因素結果和正交試驗結果證明糖化時間180 min時，燕麥黃酒的品質最為優秀。為節約時間，選擇180 min為最佳糖化時間。

3.1.2 發酵結果

單因素說明酵母添加量0.9%后，可溶性固形物含量及pH均保持不變。但正交試驗表明，酵母量添加量1.1%時，所得的燕麥黃酒品質更為優秀。綜合考慮，選擇1.1%為最佳酵母添加量。

單因素試驗結果說明酵母的最適溫度應在27～30 ℃。正交試驗方差分析和對比試驗進一步證明，燕麥黃酒的發酵溫度30 ℃時的質量優于27 ℃。因此，選擇30 ℃為最優發酵溫度。

發酵時間6 d時燕麥酒的糖分已達到充分發酵。但在選定的正交試驗組別中，發酵時間在4 d的組別評分優于6 d的組別。在綜合其余最優條件的燕麥黃酒發酵中，發酵時間4 d的產品表現更為突出。故選擇4 d作為最優發酵時間。

3.1.3 結論

通過單因素與正交試驗確定燕麥黃酒的最佳工藝條件，即最佳糖化條件為糖化酶添加量0.3%，糖化時間180 min。最佳發酵工藝為酵母添加量1.1%、發酵溫度30 ℃、發酵時間4 d。在此條件下進行過濾殺菌得到燕麥黃酒。酒樣理化指標分析符合國家要求。試驗為液態化燕麥黃酒的發酵提供依據。

3.2 討論

3.2.1 與傳統發酵技術對比

與利用酒曲發酵燕麥黃酒的傳統試驗相比，雖然在糖化部分所采用的溫度更高，但成品可現實其釀造（僅指糖化和主發酵）時間明顯低于傳統釀造工藝所需的30 d。發酵溫度及酵母用量也低于部分文獻的試驗結論。

燕麥黃酒的液化法發酵很大程度上節省釀造時間，提高釀造效率。從能源消耗來看，液態法發酵更加節約能源，減少成本。

3.2.2 與已有結果對比

與劉浩等[11]的液態發酵燕麥黃酒相比，試驗結果得出發酵時間對燕麥黃酒品質的影響，且設計糖化與發酵的綜合正交試驗。糖化方面影響：糖化酶添加量＞發酵時間。發酵方面影響：酵母添加量＞發酵溫度。說明在燕麥黃酒的液態發酵過程中，發酵時間與酵母添加量比糖化時間起著更為重要作用；而糖化酶添加量在試驗中應最為注意。