磁性殼聚糖微球固定化NAD激酶的制備及穩定性

潘自強，楊佳麗，趙希榮

淮陰工學院生命科學與食品工程學院，農產品生物加工與分離實驗室（淮安 223003）

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（NAD 激酶，NADK）是目前發現的生物體內唯一催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）的酶[1]，可以催化NAD（H）以ATP或poly（p）作為磷酰基供體進行磷酸化反應，生成NADP（H）[2-3]。由于NAD激酶價格昂貴，在實際生產NADP過程中難以回收，使得生產成本大大增加。將NAD激酶進行固定化，減少后期分離程序，實現固定化酶的重復利用就顯得非常有意義[4]。目前，酶固定化常采用吸附、交聯、包埋等技術；其中共價交聯法固定酶時，能在較溫和的條件下將酶很好的固定在載體上[5]。殼聚糖（chitosan，β-1,4-2-氨基葡萄糖，CS）是一種氨基多糖，具有無毒、可生物降解、生物相溶性等優點。殼聚糖分子鏈上存在大量的氨基和羥基，故常作為磁性-高分子材料的“外殼”被廣泛應用于酶的固定化[6]。磁性殼聚糖微球作為一種新型功能高分子材料，已作為載體被廣泛應用于酶的固定化領域[7-8]。研究以磁性殼聚糖微球為載體，戊二醛做交聯劑對NAD激酶固定化進行探究（試驗路線見圖1）；優化酶固定化條件，并探究固定化酶的相關穩定性，旨在試驗酶的重復利用。

圖1 酶固定化的試驗路線

1 材料與方法

1.1 儀器

真空冷凍干燥機（LABCONCO，美國）；KQ-300DE型數控超聲清洗器（昆山儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（常州高德儀器有限公司）；臺式離心機（上海安亭儀器有限公司）；UV-1200紫外可見分光光度計（上海美譜達）；S-3000N掃描式電子顯微鏡（日本）。

1.2 試劑與藥品

NAD激酶（由淮安美靈生物酶科技有限公司所贈）；殼聚糖（分子質量20萬 Da，脫乙酰度＞90%）；FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、NaOH、乙酸、異丙醇、丙酮、乙醇、25%戊二醛、石蠟油、Span-80、硬脂酸鎂、甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽及6-偏磷酸鈉均為市售分析純，購自國藥化學試劑有限公司；NAD+（純度98%，淮安精科化玻儀器有限公司）；6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6 U/mg，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 磁性載體的構建

1.3.1 磁流體的制備

將FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O按照物質的量比1.75∶1的混合溶液加到三口燒瓶中，向其中逐滴滴加1.5 mol/L NaOH直至pH達到10或以上。在45 ℃水浴條件下劇烈攪拌30 min，75 ℃條件下陳化1 h，使所得Fe3O4微粒充分熟化后冷卻至室溫。Fe3O4微粒冷卻后，分別用乙醇、蒸餾水反復清洗，磁分離真空干燥備用。

1.3.2 Fe3O4-CS微球的制備

準確稱取0.3 g殼聚糖溶于20 mL體積分數1.5%的乙酸中，加入0.4 g Fe3O4，超聲混勻。在三口瓶中加入80 mL石蠟油，7 mL Span-80和少量的硬脂酸鎂，在40 ℃水浴條件下混合均勻，然后逐滴加入Fe3O4的殼聚糖溶液。緩慢攪拌30 min，加入5 mL甲醛，反應1 h，然后加入1 mol/L的NaOH，維持體系的pH為10左右，升溫至60 ℃，繼續反應2 h。減壓過濾，依次用異丙醇，丙酮，乙醇，去離子水清洗。真空干燥得磁性微球，保存在冰箱內。

1.4 Fe3O4-CS微球性質考察

1.4.1 Fe3O4-CS微球的熱失重分析

取一定量樣品置于空坩堝內，試驗氣氛為氮氣，設置試驗溫度從25 ℃升到1 000 ℃，試驗完畢打印TG曲線圖。

1.4.2 Fe3O4-CS微球的形態觀察

將少量待測樣品涂布于雙面導電膠并固定于金屬板上，噴金后用于掃描電子顯微鏡（SEM）觀察Fe3O4-CS微球的形態。

1.5 固定化酶的制備

稱取干燥的Fe3O4-CS微球50 mg加入pH 9.0的磷酸緩沖液中，加入NAD激酶酶液300 μL，采用3.75%戊二醛做為交聯劑共價固定，60 ℃搖床固定反應6 h，反應結束后，用去離子水反復洗滌去除未反應的戊二醛，將制備好的固定化酶進行磁分離，真空冷凍干燥后室溫保存[9-10]。

1.6 酶活的測定

試驗中采用間接法測定NAD激酶酶活。

反應體系Ⅰ：分別向離心管中加入50 mmol/L NAD+、50 mmol/L 6-偏磷酸鈉、50 mmol/L Mn2+和pH 7.5的1 mol/L Tris-HCl緩沖液各100 μL，加固定化酶50 mg，去離子水補足體積至1 000 μL，混勻，于35 ℃的水浴中反應1 h，沸水浴1 min終止反應，以8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

反應體系Ⅱ：取900 μL上述上清液，加入100 μL 50 mmol/L的葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽，混勻，測定OD340值；然后加入0.05 U/μL的6-磷酸葡萄糖脫氫酶10 μL，37 ℃反應10 min，測定OD340’值。OD340的差值（OD340’-OD340）代表NAD激酶的酶活。

1.7 固定化條件優化

對固定化酶酶活影響較大固定化溫度、戊二醛濃度、pH及固定化時間因素進行優化[11-12]。

1.7.1 固定化溫度

按照1.4的操作，設置固定化溫度為30，40，50，60和70 ℃，其他因素不變，每組平行測量3次，計算酶活力回收率。

1.7.2 pH

按照1.4的操作，設置pH為5.0，6.0，7.0，8.0和9.0，其他因素不變，每組平行測量3次，計算酶活力回收率。

1.7.3 戊二醛濃度

按照1.4的操作，設置戊二醛體積分數為1.25%，2.5%，3.75%，5.0%和6.25%，其他因素不變，每組平行測量3次，計算酶活力回收率。

1.7.4 交聯時間

按照1.4的操作，設置交聯時間為4，6，8，10和12 h，其他因素不變，每組平行測量3次，計算酶活力回收率。

1.8 固定化酶穩定性研究

1.8.1 重復使用穩定性

每次固定化酶催化反應完成后，磁分離回收固定化酶，蒸餾水洗滌3次，加到新的酶反應體系中，測量酶活，重復8次。以初次測量的酶活力回收率為100%，計算每次使用后的相對酶活力回收率[13]。

1.8.2 儲存穩定性

固定化酶冷凍干燥后，置于4 ℃冰箱中保存。分別于第1，第2，第4，第6，第8，第10和第12天取出測量酶活，以第1天測量的酶活力為100%，計算第2，第4，第6，第8，第10和第12天的相對酶活力回收率[14-15]。

2 試驗結果

2.1 Fe3O4-CS微球性質考察

2.1.1 傅里葉紅外譜圖

圖2和圖3為Fe3O4（a）與Fe3O4/CS（b）微球的FT-IR譜圖。

圖2 Fe3O4的FTIR圖譜

從圖3中可以看出，譜線（a）于588 cm-1有強吸收峰，此處對應于Fe3O4中Fe-O特征伸縮振動吸收峰。譜線（b）在588 cm-1附近也有吸收峰，并且與譜線（a）中Fe3O4的特征吸收峰非常相似，說明Fe3O4/CS微球中有Fe3O4，殼聚糖確實包埋了Fe3O4。譜線（b）在3 431 cm-1附近有紅外吸收，這是－OH和－NH2的伸縮振動峰，2 892 cm-1附近為殼聚糖中C－H的伸縮振動吸收峰，1 084 cm-1附近為C－O峰。譜線（b）中既出現了殼聚糖的特征吸收峰，又在1 649 cm-1處出現Shiff堿鍵C==N的特征吸收峰，說明磁性微球的外層成功包埋了殼聚糖，并且交聯劑戊二醛和殼聚糖發生了交聯反應。

圖3 Fe3O4/CS的FTIR圖譜

2.1.2 Fe3O4-CS微球熱失重分析

Fe3O4-CS微球熱失重分析如圖4。

圖4 Fe3O4-CS微球熱失重分析

由圖4中可以看出，Fe3O4-CS微球在0～100 ℃有失重，其值為3.25%，表明載體中含有少量的水分和可揮發性物質。第二個失重階段在200～650 ℃溫度范圍內，其值為69.62%，這部分失重來源于殼聚糖的分解。隨著溫度繼續升高，曲線趨于平穩，表明殼聚糖已經分解完全，剩下不能被燃燒的Fe3O4。以上結果表明，制備的Fe3O4-CS微球中殼聚糖的含量在60%以上。

2.1.3 掃描電子顯微鏡（SEM）

觀察電鏡掃描放大24 000倍結果見圖5所示。

圖5 掃描電鏡結果（放大24 000倍）

圖5（a）Fe3O4粒子的微觀形貌呈不規則的類球狀，存在輕微團聚現象；圖5（b）Fe3O4-CS微球的表面凹凸不平，與Fe3O4粒子表面形貌有顯著差異。結合熱失重分析，說明Fe3O4粒子被殼聚糖包裹形成Fe3O4-CS微球。

2.2 固定化條件優化

2.2.1 固定化溫度

對酶活力回收率的影響當溫度為30，40，50，60和70 ℃時，酶活力回收率分別為18.72%，36.45%，41.38%，64.04%和28.57%；固定化溫度為60 ℃時，酶活力回收率最高為64.04%。

圖6 溫度對酶活力回收率的影響

2.2.2 pH對酶活力回收率的影響

當pH為5.0，6.0，7.0，8.0和9.0時，酶活力回收率分別為15.32%，20.84%，40.51%，57.14%和38.42%；固定pH為8.0時，酶活力回收率最高為57.14%。

圖7 pH對酶活力回收率的影響

2.2.3 戊二醛體積分數對酶活力回收率的影響

當戊二醛體積分數為1.25%，2.5%，3.75%，5.0%和6.25%時，酶活力回收率分別為26.6%，37.44%，42.36%，30.54%和24.63%；戊二醛體積分數為3.75%時，酶活力回收率最高為42.36%。

圖8 戊二醛體積分數對酶活力回收率的影響

2.2.4 交聯時間對酶活力回收率的影響

當交聯時間為4，6，8，10和12 h時，酶活力回收率分別為16.75%，39.41%，34.69%，23.63%和18.65%；交聯時間為6 h時，酶活力回收率最高為39.41%。

圖9 交聯時間對酶活力回收率的影響

2.3 正交試驗正交

試驗根據以上單因素試驗結果，選擇溫度（A）、pH（B）和戊二醛體積分數（C）和交聯時間（D）作為考察影響酶活固定率的主要因素，每個因素設3個水平，按L9(34)正交表進行試驗，因素水平見表1。

表1 因素水平表

試驗結果如表2所示，RA＞RC＞RB＞RD，故4個因素的主次順序為A＞C＞B＞D，即A、C因素對酶活力回收率影響較大，B、D因素對酶活力回收率影響較小。A因素優水平為A3，C因素優水平為C2，最終確定優化組合為A3B3C2D1，該條件下酶活力回收率為56.16%。

表2 正交設計表

2.4 驗證試驗

根據1.4的操作，采用正交試驗優選的工藝條件固定溫度60 ℃、pH 9.0、戊二醛體積分數3.75%、固定時間6 h平行制備3份固定化酶，酶活力回收率分別為56.2%，55.37%和52.0%，表明該制備工藝穩定。

2.5 穩定性試驗

2.5.1 操作性穩定性

固定化酶在相同條件下連續測量8次，計算酶活回收率。以初次測量的酶活力回收率為100%，之后測量的酶活力回收率分別為90.67%，86.85%，80.06%，75.98%，65.06%，60.81%和55.89%，結果可知，隨著使用次數增加，固定化酶的酶活力回收率緩慢下降；連續使用8次后，固定化酶酶活力回收率剩余55.89%，表明固定化酶有良好的重復使用性。固定化酶重復使用次數增加可能是由于采用戊二醛進行表面修飾，增強了固定化酶的機械強度，提高了固定化酶的操作穩定性。

圖10 固定化酶的操作穩定性結果

2.5.2 儲存穩定性

固定化酶置于4 ℃冰箱中，于固定化后的第1，第2，第4，第6，第8和第10天取出測量酶活力回收率。以初次測量的酶活力回收率為100%，其他幾次酶活力回收率結果見圖11。結果所示，隨著儲存時間的增加，酶活力回收率略降低，儲存10 d后酶活力回收率為93.12%，儲存穩定性較好。

圖11 固定化酶的儲存穩定性結果

3 結論

研究通過共沉淀制備Fe3O4，殼聚糖包裹制備Fe3O4-CS微球。通過戊二醛做交聯劑將NAD激酶固定在Fe3O4-CS微球上。對影響酶活力回收率的單因素（溫度、戊二醛體積分數、pH、交聯時間）進行考察，設計正交試驗確定最優固定條件，確定最適工藝為固定溫度60 ℃、pH 9.0、戊二醛體積分數3.75%、交聯時間6 h，該條件下酶活力回收率為56.16%。對最優固定條件進行穩定性驗證，結果為56.2%，55.37%和52.0%，結果表明該工藝制備穩定可用于后續試驗。對固定化酶進行穩定性試驗，固定化酶重復使用8次后，固定化酶酶活力回收率剩余55.89%；4 ℃冰箱儲存10 d后酶活力回收率為93.12%，以上表明固定化酶的穩定性較好。