體外模擬消化對小麥低聚肽抗氧化活性影響

凌空，張銘晧，高麗輝，馮曉文，谷瑞增，劉文穎*

1.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心（北京 100015）；2.北京林業大學生物科學與技術學院（北京 100083）；3.北京農學院食品科學與工程學院（北京 102206）

小麥谷朊粉又稱小麥蛋白粉或者小麥面筋粉，是小麥淀粉生產中的副產品，通過除去小麥面團中的淀粉，再經過烘干處理所制成的蛋白復合物[1]。小麥谷朊粉的蛋白質含量在70%以上，作為植物源蛋白質，含有大量人體必需氨基酸、礦物質、硫胺素、核黃素、煙酸、維生素A及維生素C等[2-3]。

小麥低聚肽是以小麥谷朊粉為原料，經調漿、定向酶解、特定的小肽分離、過濾、噴霧干燥等工藝獲得的小分子多肽類混合物，主要成分是由2～6個氨基酸分子構成的小肽，分子質量低于1 000 Da。小麥低聚肽具有水溶性好、分散穩定、易吸收、生物活性強等特點。小麥低聚肽中氨基酸含量均衡，幾乎與小麥谷朊粉一樣，其中谷氨酸含量最高，大部分以谷氨酰胺的形式存在[4]。谷氨酰胺為人體內含量最豐富的氨基酸，在人體中發揮重要的功效，對腸道屏障功能有顯著的保護作用。

機體在代謝過程中會產生一系列活性氧，正常情況下機體自身的防御體系可維持體內氧化與抗氧化平衡，防止過氧化反應。但是當機體受到環境毒物影響、自身發生衰老、處于精神緊張狀態、某些外源性藥物入侵時，此平衡會被打破，抗氧化體系發生紊亂，自由基代謝平衡失調，使機體處于氧化應激狀態，進而造成生物膜及大分子物質發生脂質過氧化損傷，并且機體氧化應激狀態與炎癥、免疫力降低、衰老、心血管疾病、糖尿病、癌癥等多種疾病的發生發展密切相關[5-8]。外源性抗氧化物質有助于維持體內的氧化還原平衡，而小麥低聚肽以其良好的吸收特性及天然安全特性得到廣泛關注[9-10]。Zhu等[9]采用體外試驗方法研究了小麥胚芽蛋白水解所得到的低聚肽的抗氧化活性，結果顯示，低聚肽的抗氧化活性接近于亞油酸乳液體系中的α-生育酚，且具有清除1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）自由基、過氧化物和羥自由基（·OH）的活性。目前，對小麥低聚肽抗氧化活性的研究多集中在體外抗氧化指標的測定。研究采用胃蛋白酶和胰蛋白酶對小麥低聚肽進行體外模擬消化，探討消化前后小麥低聚肽分子質量的變化；通過評價DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、總抗氧化能力（ABTS法）和氧自由基吸收能力（ORAC值），進一步研究小麥低聚肽消化前后抗氧化能力的變化，為相關功能性食品的開發提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥谷朊粉，安徽中弘生物工程有限公司；中性蛋白酶（≥1 600 AU/g）、堿性蛋白酶（≥400 000 DU/g），杜邦丹尼斯克公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Fluorescein（熒光指示劑）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）、分子質量標準品、胃蛋白酶（≥250 units/mg），美國Sigma公司；胰蛋白酶（≥250 NFU/mg），美國Solarbio公司；乙腈（色譜純），美國Fisher公司產品；ABTS自由基清除能力檢測試劑盒，碧云天生物技術研究所；其他分析純試劑，北京化工廠。

HH-501型超級恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱，北京陸希科技有限公司；Spectra MR多功能酶標儀，美國Dynex；LC-20A高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；SpectraMax i3x多功能酶標儀，美國MD公司；SI-114型電子天平，美國Denver Instrument公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥低聚肽的制備

利用中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解小麥谷朊粉。稱取400 g的谷朊粉，用蒸餾水溶解并定容至5 L，加入片堿或鹽酸調節pH，50 ℃下酶處理4 h，酶解結束后在100 ℃沸水浴條件下滅酶，冷卻至室溫后離心，經陶瓷膜吸附和超濾膜過濾后，噴霧干燥備用[11-12]。工藝路線如下：

小麥谷朊粉→酶解→離心→小麥肽粗品→吸附→過濾→噴霧干燥→小麥低聚肽

1.2.2 小麥低聚肽體外模擬消化

體外模擬胃液消化實驗：將5.0 g小麥低聚肽和0.2 g NaCl溶解于去離子水中，用1.0 mol/L的HCl調溶液pH至2.0，加入0.05 g胃蛋白酶于37 ℃水浴恒溫消化2 h，100 ℃沸水浴滅酶后冷卻至室溫，用1.0 mol/L NaOH溶液調節pH至7.5，定容至100 mL。空白對照不加胃蛋白酶，其余處理流程相同[13-14]。

體外模擬腸液消化實驗：將5.0 g小麥低聚肽和0.68 g KH2PO4溶解于去離子水中，用1.0 mol/L NaOH調節溶液pH至7.5，加熱至37 ℃后，加入0.05 g胰蛋白酶，37 ℃恒溫消化4 h后100 ℃沸水浴滅酶，冷卻至室溫，定容至100 mL。空白對照不加胰蛋白酶，其余處理流程相同[13-14]。

1.2.3 DPPH自由基清除率測定

將樣品用去離子水稀釋為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL 8個不同質量濃度梯度，分別與濃度為0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液等體積比例混合均勻，室溫避光反應30 min，置于波長517 nm處測定吸光度Ay；同時以不同濃度的樣品溶液與無水乙醇等體積混合，測得吸光度A1；用蒸餾水代替樣品作為空白對照，與同體積0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，測得吸光度A2[15]。根據公式計算得到對DPPH自由基清除率：

1.2.4 ·OH清除率測定

參照Fenton反應體系，對消化處理前后小麥低聚肽的·OH清除作用進行對比。將樣品用去離子水稀釋為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL 8個不同質量濃度梯度。分別將不同濃度的樣品溶液與5 mmol/L FeSO4溶液、5 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液以1∶2∶2的體積均勻混合。試驗組以1體積5.0 mmol/L H2O2溶液開啟反應；對照組以1體積蒸餾水開啟反應；空白對照組以蒸餾水代替樣品。37 ℃恒溫孵育1 h后于510 nm處測量吸光度，試驗組、對照組和空白對照組的吸光度分別記為Aw、A1、A2[16]。根據公式計算得到對·OH的清除率：

1.2.5 總抗氧化能力測定

將ABTS溶液與過硫酸鉀混合反應形成墨綠色ABTS+工作液，靜置12 h，待工作液穩定后備用。使用前用pH 7.4，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋35倍成為ABTS工作液，使其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。向96孔板的每個孔中加入200 μL ABTS工作液，同時在標準曲線檢測孔中加入10 μL不同濃度的Trolox（水溶性維生素E）標準溶液，在樣品檢測孔加入10 μL樣品溶液，緩緩混勻后室溫孵育6 min，于734 nm處測定吸光度。樣品的抗氧化能力以mmol/g Trolox表示[17]。

1.2.6 ORAC值測定

熒光96 孔板中加入25 μL樣品，25 μL Trolox標準品（6.25，12.5，25，50，100，250，500 μmol/L）作為陽性對照（制作標準曲線），以及100 μL的Fluorescein（熒光指示劑，0.8 μmol/L），于37 ℃保溫20 min，然后加入75 μL，150 mmol/L偶氮類化合物AAPH，熒光酶標儀激發波長485 nm，發射波長530 nm，每隔2 min測定1次，測定總長時間為120 min，以pH 7.4，75 mmol/L的PBS為空白對照；另外做不加AAPH的對照。根據標準曲線計算待測樣品的ORAC值，結果表示為μmol/g Trolox[18-19]。

1.2.7 分子質量分布測定

利用高效液相凝膠色譜法測定小麥低聚肽的分子質量。色譜柱，TSKgel G2000 SWXL 300×7.8 mm；流動相，V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45∶55∶0.1；流速，0.5 mL/min；進樣體積，10 μL；檢測波長，220 nm；柱溫，30 ℃。樣品用流動相配制為1.0 mg/mL的溶液，并利用孔徑0.2 μm聚四氟乙烯濾膜過濾，通過高效液相色譜儀進行凝膠過濾，紫外檢測器進行檢測，最后通過GPC軟件處理色譜數據。同時配制4種0.1 g/100 mL標準品溶液：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子質量189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子質量451 Da）、桿菌酶（分子質量1 450 Da）和細胞色素C（分子質量12 500 Da），制作分子質量標準曲線。

1.2.8 數據分析

數據利用Origin 8.5軟件（OriginLab Corp.，Northampton，MA，USA）處理。試驗結果用平均值±標準偏差表示，每組數據平行測定3次。

2 結果與分析

2.1 小麥低聚肽消化前后的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除法是利用電子轉移和電荷中和的原理，是評價物質抗氧化能力的一項重要指標。DPPH自由基在有機環境中是一種穩定的N離子自由基，在517 nm波長處具有最大吸收峰。當DPPH自由基的單電子被體系中自由基清除劑中和后，其溶液顏色由紫色變為淺黃或無色，直接表現為吸光度數值的下降。圖1顯示了經胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后小麥低聚肽對DPPH自由基清除能力的變化。小麥低聚肽的DPPH自由基清除能力隨濃度的升高而加強。未經處理的低聚肽清除能力稍強于消化后的低聚肽，IC50值分別為IC50胃蛋白酶處理=0.75 mg/mL，IC50胃蛋白酶對照=0.63 mg/mL，IC50胰蛋白酶處理=1.52 mg/mL，IC50胰蛋白酶對照=0.96 mg/mL。因此，小麥低聚肽模擬消化后的DPPH自由基清除活性略有下降，但仍可保持較高的水平。

圖1 不同處理的小麥低聚肽對DPPH自由基清除作用

2.2 小麥低聚肽消化前后的·OH清除能力

·OH是體內最活潑的一種自由基，幾乎能與所有生物大分子發生反應，氧化性極強，對人體危害性最高[20]。由圖2可知，小麥低聚肽的·OH清除能力隨濃度的升高而提升。經消化酶處理后，其·OH清除能力與未處理的相比，僅有輕微下降。IC50分別為IC50胃蛋白酶處理=14.82 mg/mL，IC50胃蛋白酶對照=12.85 mg/mL，IC50胰蛋白酶處理=11.01 mg/mL，IC50胰蛋白酶對照=9.83 mg/mL，說明小麥低聚肽對·OH清除能力具有較好的消化穩定性。

圖2 不同處理的小麥低聚肽對·OH清除作用

2.3 小麥低聚肽消化前后的總抗氧化能力

通過ABTS自由基清除法評價小麥低聚肽消化前后的總抗氧化能力。此方法的原理是，以ABTS為顯色引發劑，當加入氧化劑后，ABTS試劑在水溶液環境中可形成穩定的藍綠色ABTS自由基，在波長734 nm處有最大吸收。當加入抗氧化性物質后ABTS自由基的電荷被中和，顏色變淺，吸光光度值隨之下降，下降趨勢可表明所檢測物質抗氧化活性的強弱[21]。根據Trolox標準品繪制的ABTS標準曲線如圖3所示。經計算，小麥低聚肽消化前后的總抗氧化能力見表1。與對照組相比，經胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，小麥低聚肽對ABTS自由基的清除能力略有下降，但沒有明顯變化。因此推測，小麥低聚肽在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下沒有發生大的結構和性質變化。

圖3 ABTS標準曲線

表1 不同處理的小麥低聚肽的總抗氧化能力

2.4 小麥低聚肽消化前后的ORAC值

ORAC全稱為oxygen radical absorbance capacity，被譯為氧自由基清除能力或抗氧化能力指數，是目前抗氧化研究領域中為人們所關注的一個評價方法[22]。不同濃度Trolox的動態熒光衰減曲線見圖4，繪制的標準曲線如圖5所示，y=0.842x+0.091 3，R2=0.998 3。根據標準曲線，計算最終小麥低聚肽消化前后的ORAC值，如表2所示。小麥低聚肽經胰蛋白酶消化后，ORAC值略有提高，但沒有明顯變化；胃蛋白酶消化后，ORAC值降低了15.7%。推測經胃蛋白酶處理后，小麥低聚肽不同肽段中部分抗氧化氨基酸殘基被消化而導致ORAC值降低。

圖4 不同濃度Trolox的動態熒光衰減曲線

圖5 Trolox的標準曲線

表2 不同消化方式下小麥低聚肽的ORAC值變化

2.5 小麥低聚肽消化前后的分子質量分布

由表3可知，小麥低聚肽的分子質量主要集中在150～1 000 Da，占總比例的70%以上，具有良好的水溶性、消化吸收性[23]。小麥低聚肽大多由2～10個氨基酸的短肽組成。胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，低聚肽的各區間分子質量分布變化很小，重均分子質量輕微減少，不超過0.3%。由此看出，小麥低聚肽具有較強的抗消化能力，小肽尤其是抗氧化性短肽基本不受蛋白酶作用的影響，這也進一步解釋了小麥低聚肽消化后抗氧化活性得以保持的原因。

表3 不同處理的小麥低聚肽的分子質量分布

3 結論

酶解制得的小麥低聚肽，分子質量小于1 000 Da的部分占比在80%以上，有易吸收、溶解性好的特點。通過DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、總抗氧化能力和ORAC值測定試驗，證明了酶法制備的小分子小麥低聚肽經模擬胃腸道消化后仍有較好的抗氧化活性，與未消化處理的相比變化不大。胰蛋白酶消化較胃蛋白酶消化對小麥低聚肽的抗氧化活性影響更小，保證了它在吸收過程中仍具有較強的抗氧化活性。試驗證實了小麥低聚肽具有較強的消化穩定性和抗氧化活性，為其在天然功能性保健食品中的應用提供了思路和理論支持。