酶解工藝對紅花籽粕酶解液產物及特性的影響

呂凱波，龔乃超

武漢工商學院環境與生物工程學院（武漢 430065）

紅花籽，中藥稱“白平子”，是紅花（Carthamus tinctoriusL.）的種子[1]。紅花籽中含油率在35%～40%之間，去油后紅花籽粕無毒、無異味，粗蛋白質含量在20%～60%之間，其中含有18種人體所需的氨基酸，其中8種為含量較高的必需氨基酸[2]，蛋白消化率為77%[3-4]。紅花籽粕還含有黃酮類、木脂素、糖苷、多酚以及苯丙烯酞-5-羥色胺等多種微量成分[5]，具有較高的營養價值和藥用價值，極具商業開發價值和廣泛應用空間。但目前一般作為廉價的肥料和飼料，利用率較低，其商業附加值不高。

利用食品級蛋白酶可直接獲得安全性高、活性好的酶解產物[6]，從而得到更豐富的食品營養強化劑和添加劑，是目前提高植物蛋白附加值常用的方法。國內外通過酶解蛋白研究酶種類及其多肽分子量分布和產物功能特性的影響報道較多，希望通過酶改性，蛋白質在其乳化性、乳化穩定性等方面有顯著改善，進而擴大其在食品領域內的應用[7]。目前國內對紅花籽粕蛋白營養及提取方法、酶解工藝及制備抗氧化肽都有一定的研究基礎，前期也嘗試酶法水解籽粕為原料開發出多肽飲料[8]，此次試驗期望通過不同酶解工藝得到酶解液，研究產物的穩定性、抗氧化性功能，為進一步開發紅花籽粕資源提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅花籽粕粉末（壓榨法提油后得到的紅花籽粕，干燥粉碎后，過孔徑0.425 mm篩）；中性蛋白酶（60 000 U/g，武漢市華生物技術有限公司）；木瓜蛋白酶（800 U/mg，源葉生物）；堿性蛋白酶（240 000 U/g，丹麥諾維信）；鐵氰化鉀（AR）；Tris（上海麥克林生化科技有限公司）。

HH-2恒溫水浴鍋（金壇市宏華儀器廠）；TG16-WS高速離心機（湘麓離心機儀器有限公司）；722E型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；RRH-A400型高速多功能粉碎機（上海緣沃工貿有限公司）；KQ-100E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）JM-A2002型；電子天平（諸暨市超澤衡器設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅花籽粕化學成分分析[9]

粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法；粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法；水分含量的測定采用干燥恒重稱量法；灰分含量的測定采用馬弗爐灰化法；總糖含量的測定采用硫酸-酚法。

1.2.2 紅花籽粕酶解液的制備

采用表1中的酶解工藝對紅花籽粕進行水解。

表1 5種蛋白酶酶解工藝

其中，樣品4超聲波輔助酶解工藝：5%紅花籽粕溶液在超聲頻率40 kHz、超聲溫度55 ℃條件下，超聲20 min后，加入木瓜蛋白酶酶解2 h。以底物質量計酶活，于100 ℃水浴10 min滅酶，按4 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為紅花籽粕酶解液。

1.2.3 游離氨基氮含量測定

采用茚三酮比色法[14]。

1.2.4 可溶性蛋白含量測定

采用Folin-酚法[15]。

1.2.5 乳化性及乳化穩定性測定

采用濁度法[16]。

1.2.6 抗氧化性測定[17]

測定還原力、清除DPPH自由基能力和清除羥自由基能力。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 紅花籽粕化學成分分析

由表2可知，紅花籽粕中粗蛋白含量接近40%，將其作為廉價的肥料和飼料會造成蛋白質資源的極大浪費。采用1.2.2方法酶解籽粕，對酶解產物進行進一步研究。

表2 紅花籽粕化學成分分析

2.2 酶解液游離氨基氮含量

以游離氨基氮質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，標準曲線如圖1所示。回歸方程為y=0.006 1x+0.000 2，R2=0.998 6（＞0.99），表明線性關系較好。

圖1 游離氨基氮標準曲線

將樣品測定的吸光度代入標準曲線中，計算酶解液中游離氨基氮的含量，結果如圖2所示。樣品3中的游離氨基氮含量最低，樣品4和樣品5最高，樣品1和樣品2次之；樣品3的酶解液水解度最小，說明木瓜蛋白酶與中性蛋白酶混合使用，水解效果不突出；樣品4和樣品5游離氨基氮最高，表明紅花籽粕在木瓜蛋白酶或中性蛋白酶酶解時較充分。樣品1和樣品4相比，樣品4游離氨基氮含量更高，說明同一酶解工藝下，超聲波輔助處理紅花籽粕蛋白有利于提高酶解效果。

圖2 酶解液中游離氨基氮的含量

2.3 酶解液可溶性蛋白質含量

以橫坐標為蛋白質質量濃度，縱坐標為吸光度，標準曲線如圖3所示。回歸方程為y=0.052 6x+0.010 1，R2=0.997 9（＞0.99），表明線性關系較好。

圖3 可溶性蛋白標準曲線

將樣品測定的吸光度代入標準曲線中，計算酶解液中可溶性蛋白質含量，結果如圖4所示。試驗結果與游離氨基氮含量檢測結果趨勢一致，樣品3中可溶性蛋白質含量最低，樣品4和樣品5最高，樣品1和樣品2次之。經過相關性分析：5種酶解方式下游離氨基氮含量與可溶性蛋白質含量呈極顯著相關性，相關系數為0.92；這是由于酶解的作用，蛋白質長鏈被逐漸切斷，可溶性蛋白大量增加，其中小分子的游離氨基氮也隨水解程度加深而增加[18]，由此推測此時水解液中小分子物質中呈味物質也會不斷增加。

通常認為水解液中可溶性蛋白在一定程度上可以表征蛋白質的水解度[19]。由圖3和圖4可知，游離氨基酸和可溶性蛋白趨勢一致，說明不同蛋白酶酶解紅花籽粕得到的酶解產物、酶解效果均有明顯差異，其中超聲波輔助木瓜蛋白酶酶解工藝最佳，其次為中性蛋白酶酶解工藝。

圖4 酶解液中可溶性蛋白含量

2.4 酶解液乳化性及乳化穩定性

由圖5可知，樣品2乳化性最好，樣品4和樣品3次之，樣品5和樣品1最差；說明堿性蛋白酶水解紅花籽粕后形成乳狀液的能力最強，而水解度較高的樣品4次之；這可能是因為水解度增加，多肽數量增加，疏水性氨基酸側鏈外露，蛋白質分子中靜電荷數量上升，蛋白質的乳化性在一定程度上增加；水解度較大時，當端基數目增加到一定程度后，電荷繼續增大，親水性也隨著增加，吸附油滴能力下降，乳化性又降低[20]。

圖5 酶解液乳化性和乳化穩定性

由圖5可知，樣品4和樣品5乳化穩定性最好，樣品2次之，樣品1和樣品3最差。采用超聲波輔助木瓜蛋白酶酶解工藝的樣品乳化穩定性最好；說明水解作用降低了分子的體積，增加了離子化基團的數量和分布，在形成乳狀液中液珠間吸引作用小于其間的排斥作用，二者不易聚結，因此酶解液乳化穩定性較好[21]。

從乳化性和穩定性二者結合來看，樣品4乳化性和乳化穩定性要明顯好于樣品1，說明超聲處理對其有影響，超聲波處理能改善蛋白質在水溶液中的分散效果和蛋白質的分子作用力。由圖4和圖5可知，不同蛋白酶酶解紅花籽粕得到的酶解產物，其乳化性和乳化穩定性有明顯差異。一般說來，水解液中含氮化合物及蛋白質含量越高，樣品乳化穩定性也高。

2.5 酶解液抗氧化性分析

抗氧化肽具有抑制生物大分子過氧化或清除體內自由基的功能，食用安全性高等優點，使其成為近年來國內外的研究熱點[22-23]。如表3所示，樣品4和樣品2還原力最好，樣品5次之，樣品3和樣品1最差，可能是因為在適當的水解度下，有較多的活性氨基酸或肽類被釋放，具有較強的供氫或供電子的能力；樣品1和樣品4的DPPH自由基清除率最強，其次為樣品2和樣品5，樣品3最差；對于羥自由基清除率，樣品2和樣品4較好，其他3種相差不大。綜合對比3個抗氧化性指標，樣品4最佳。這可能是因為在此條件下，水解度增加，具有抗氧化性活性肽段不斷被暴露出來。

表3 酶解液抗氧化性

3 結論

以紅花籽粕作為原料，對比不同酶解工藝下酶解產物的游離氨基氮、水溶性蛋白、乳化性及乳化穩定性、抗氧化性。結果表明：2.5 g紅花籽粕在50 mL pH 6.5 PBS、4 800 U/g木瓜蛋白酶條件下，55 ℃超聲處理20 min，酶解2 h，各項指標突出，此時游離氨基氮含量為535.52 μg/mL，可溶性蛋白含量為58.74 mg/mL，乳化性為1.26 m2/g，乳化穩定性為162.77 min，還原力為0.054±0.007，DPPH自由基清除率達（54.02± 2.8）%，羥自由基清除率達（35.16±1.4）%。以上研究結果顯示，紅花籽粕經酶解后有一定的營養價值、穩定性及抗氧化性，可作為植物源蛋白質類多肽類產品進行開發利用。