響應面法優化蟹味菇酶解工藝

江蘇食品藥品職業技術學院食品學院（淮安 223003）

蟹味菇（Hypsizygus marmoreusBigelow），又名真姬菇，屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、離褶菌族、玉蕈屬，是北溫帶一種優良的食用菌[1]。蟹味菇含有豐富維生素和17種氨基酸，其中賴氨酸、精氨酸的含量高于一般菇類，有助于青少年益智增高，還可抗癌、降低膽固醇[2-3]。蟹味菇子實體的提取物具有真菌多糖、嘌呤、腺苷等多種生理活性成分，能增強免疫力、延緩衰老、促進抗體形成等[4-5]。影響蟹味菇酶解的主要因素有酶用量、pH、溫度和時間[6]。通過單因素試驗和響應面試驗設計，研究確定蟹味菇酶解工藝條件，為蟹味菇的后期加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟹味菇（產地淮安）；風味蛋白酶（鄭州百思特食品添加劑有限公司）；纖維素酶（寧夏和氏璧生物工程有限公司）；氫氧化鈉（安徽蕪湖化學試劑廠）。

800Y粉碎機（武義海納電器有限公司）；MS304電子天平（梅特勒-托利多集團）；PHS-3E精密酸度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；TD5G離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蟹味菇預處理蟹味菇經清洗、瀝干后，置于60 ℃條件真空干燥至恒重，然后粉碎成粒徑約0.17 mm粉狀，待用。

1.2.2 蟹味菇酶解液反應

稱取一定量的蟹味菇粉，按照固液比1∶8（g/mL）制成待測液，加入一定量的風味蛋白酶（以底物百分比），調節pH，在設定溫度下進行水解處理[7]。水解結束后迅速加熱至90 ℃維持10 min滅酶活，冷卻后再經4 000 r/min離心15 min，取上清液即得酶解液。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 酶用量對酶解反應的影響

準確量取5份一定量的蟹味菇粉待測液，分別添加相對于底物的0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%的風味蛋白酶，調節pH至7.0，在40 ℃下反應5 h，水解結束后于90 ℃加熱10 min滅酶活，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，測定氨基酸態氮含量。

1.2.3.2 pH對酶解反應的影響

準確量取5份一定量的蟹味菇粉待測液，加入相對于底物的2.0%風味蛋白酶，分別調節pH至5，6，7，8和9，在40 ℃下反應5 h，水解結束后于90 ℃加熱10 min滅酶，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，測定氨基酸態氮含量。

1.2.3.3 反應溫度對酶解反應的影響

準確量取5份一定量的蟹味菇粉待測液，加入相對于底物的2.0%風味蛋白酶，調節pH至6.0，分別在30，40，50，60和70 ℃下反應5 h，水解結束后于90 ℃加熱10 min滅酶，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，測定氨基酸態氮含量。

1.2.3.4 反應時間對酶解反應的影響

準確量取5份一定量的蟹味菇粉待測液，加入相對于底物的2.0%風味蛋白酶，調節pH至6.0，在60 ℃下反應，反應時間分別設定為3，4，5，6和7 h，水解結束后于90 ℃加熱10 min滅酶，以4 000 r/min離心15 min，取上清液作為酶解液，測定氨基酸態氮含量。

1.2.4 響應面優化酶解反應

比較4個單因素試驗結果，確定酶解溫度、pH和酶解時間3個因素作為酶解反應主要影響因素，以單因素試驗中對酶解反應各因素條件的最優點設置基準點，以Design-Expert 8.0軟件Box-Behnken方法進行試驗設計[8-10]，以氨基酸態氮含量為評價指標，確定最優的酶解條件，響應面試驗設計見表1。

1.2.5 酶解效果評價

此次試驗酶解效果評價以酶解液中氨基酸態氮含量表示，酶解液中氨基酸態氮含量越高，則說明酶解效果越好。氨基酸態氮含量的測定方用選用甲醛滴定[11-12]。

稱取5.0 g樣品，用50 mL 80 ℃左右的蒸餾水分幾次洗入100 mL燒杯中，冷卻后，轉入100 mL容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混勻后過濾。吸取10.0 mL濾液，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，開動磁力攪拌器，用0.050 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示pH 8.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數，計算總酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標準滴定溶液繼續滴定至pH 9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數。同時做試劑空白試驗，氨基酸態氮含量按式（1）計算。

式中：X為試樣中氨基酸態氮的含量，g/100 g；V1為測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V2為試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；0.014為與1.00 mL NaOH標準滴定溶液（c=1.000 mol/L）相當的氮的質量，g；m為稱取試樣的質量，g；V3為試樣稀釋液的取用量，mL；V4為試樣稀釋液的定容體積，mL；100為單位換算系數。

表1 中心組合設計的因素與水平表

2 結果與分析

2.1 酶用量對酶解反應的影響結果

由圖1可知，隨風味蛋白酶用量的增加，蟹味菇酶解產生的氨基酸態氮含量也相應增加，當酶用量為2.0%時，酶解產物中氨基酸態氮含量達到最大，即酶解程度達到最大，若再繼續增加風味蛋白酶用量，酶解產物中氨基酸態氮含量則基本維持恒定，變化不大。綜合考慮蛋白酶解條件，選擇2%的風味蛋白酶用量為最佳條件。

2.2 pH對酶解反應的影響結果

由圖2可知，pH對蟹味菇酶解有較大影響。當pH由5.0至9.0分別進行試驗時，隨著pH增大，蟹味菇酶解產生的氨基酸態氮含量呈現先增后降趨勢，其中pH為6.0時，氨基酸態氮含量達到最大。當pH為5.0到6.0即弱酸性條件時，酶解程度較大，產生的氨基酸態氮含量較高；當pH在7.0到9.0即弱堿性條件時，酶解程度較小，產生的氨基酸態氮含量較低。所以，試驗選擇pH 6.0時作為最佳酶解pH。

圖1 風味蛋白酶用量對蟹味菇酶解結果的影響

圖2 酶解pH對蟹味菇酶解結果的影響

2.3 酶解溫度對酶解反應的影響結果

由圖3可知，隨著酶解溫度由20 ℃升高至70 ℃，蟹味菇酶解液中氨基酸態氮含量也相應增加，當酶解溫度為60 ℃時，氨基酸態氮含量基本達到最大，隨后溫度繼續升高，氨基酸態氮含量逐漸減小，可能是溫度過高對酶促化活性產生一定的抑制作用。所以，選擇60 ℃作為酶解溫度最佳條件。

圖3 酶解溫度對蟹味菇酶解結果的影響

2.4 反應時間對酶解反應的影響結果

由圖4可知，隨著酶解時間的不斷延長，蟹味菇酶解液中氨基酸態氮含量也相應增加，酶解3～5 h，氨基酸態氮含量不斷增加；酶解5 h以后，隨時間的繼續延長，氨基酸態氮含量基本維持較小波動范圍。從酶解徹底性分析，選擇6 h作為最佳酶解處理時間。

2.5 響應面法優化酶解反應條件

試驗以蟹味菇酶解液中氨基酸態氮含量為響應值（Y），根據Box-Behnken設計原理，安排了17個處理組合，每個處理組合設3個平行樣，取平均值，分別確定酶解液中氨基酸態氮含量（Y），試驗結果及預測見表2。

圖4 酶解時間對蟹味菇酶解結果的影響

表2 響應面分析方案及試驗結果

將表2結果代入Design-Expert 8.0進行方差分析，得多元回歸方程：Y=5.79-0.15A-0.19B-7.50×10-3C+0.087AB+0.023AC+0.10BC-0.36A2-0.63B2-0.20C2。其中，Y為氨基酸態氮含量，A為酶解溫度，B為酶解pH，C為酶解時間。對回歸方程進行方差析，結果見表3。

由表3可知，回歸模型的p＜0.000 1，檢驗結果極顯著，回歸模型失擬項p=0.181 8＞0.05，檢驗結果不顯著，復相關系數R2=0.996 8，說明回歸方程擬合程度很好。校正系數R2=0.932 7，說明該模型能解釋99.27%響應值變化，說明試驗值與預測值非常接近。對回歸方程進行分析，得到最佳酶解條件。

由圖5～圖7可知，當一個因素固定不變時，試驗初期隨另一因素增大，氨基酸態氮含量也相應增加，當達到一定程度后反應又會受到一定抑制，導致氨基酸態氮含量降低。圖6底部的等高線形狀為圓形，圖5和圖7底部的等高線形狀為橢圓形，表明酶解溫度與酶解時間之間交互作用不顯著，而酶解溫度與酶解pH、酶解pH與酶解時間交互作用顯著，該結果與方差分析結果保持一致。

表3 回歸模型的方差分析

圖5 酶解溫度和酶解pH交互作用對蟹味菇酶解結果的影響

圖6 酶解溫度和酶解時間交互作用對蟹味菇酶解結果的影響

圖7 酶解pH和酶解時間交互作用對對蟹味菇酶解結果的影響

通過對回歸方程進行分析，得到模型的極點值，即酶解溫度57.73 ℃、酶解pH 5.82、酶解時間5.92 h，此時氨基酸態氮含量達到最大值（5.824 08 g/100 mL）；考慮到實際操作，對上述優化條件進行修正：酶解溫度58 ℃、酶解pH 6.0、酶解時間6 h，并重復3次進行驗證試驗，測得氨基酸態氮平均含量為5.81 g/100 mL。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，應用Design-Expert 8.0進行方差分析優化蟹味菇酶解工藝條件。結果表明：酶解溫度、酶解pH、酶解溫度與酶解pH交互作用、酶解pH與酶解時間交互作用及各因素二次方對水解產物氨基酸態氮含量均有顯著影響。

回歸分析和驗證試驗結果表明響應面法優化蟹味菇酶解工藝條件切實可行，所得最佳酶解條件為風味蛋白酶用量2%、酶解溫度58 ℃、酶解pH 6.0、酶解時間6 h，測得氨基酸態氮含量為5.81 g/100 mL。此次試驗為蟹味菇的后期加工利用提供理論依據。