響應(yīng)面法優(yōu)化藍莓白藜蘆醇的提取工藝

姜宏宇，仇宏圖，曲可欣，馬明月，陳巍元，張華

1.延邊大學農(nóng)學院食品與生物科學系（延吉 133002）；2.延邊大學東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心（延吉 133002）

藍莓（blueberry），又名越橘、藍漿果，果實為近圓形、呈藍色的小漿果。藍莓果實中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，除了含有常見的糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等一般性營養(yǎng)成分外，還含有白藜蘆醇、多酚等具有生理功能的化學成分[1]。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種具有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，一般認為是植物在遭受惡劣環(huán)境所產(chǎn)生的防御物質(zhì)[2]。有研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、保護心血管、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[3-4]。

目前，國內(nèi)外白藜蘆醇大多都從葡萄、虎杖等植物中提取，王慧竹等[5]優(yōu)化了虎杖莖中白藜蘆醇提取工藝，得到最佳提取條件，即60%的乙醇在80 ℃下，按料液比1∶15 g/mL，提取2 h。該方法不僅溶劑用量大，耗時長，而且提取率不高，雜質(zhì)多。常永芳等[6]選用80%乙醇和80%丙酮的混合液為提取劑，得到虎杖中白藜蘆醇的最佳提取條件為V（80%乙醇）∶V（80%丙酮）=1∶3為提取液、料液比1∶6 g/mL、在70 ℃下超聲5 min，此時白藜蘆醇的提取率為2.612%。潘潤天等[7]優(yōu)化了花生紅衣中白藜蘆醇提取工藝，最佳工藝條件為取液料比值為15 mL/g，制提取時間為64 min，提取溫度為50 ℃，白藜蘆醇的含量為18.1785 μg/g。

而在藍莓中提取白藜蘆醇的有關(guān)研究較少。同時，國內(nèi)外藍莓中活性物質(zhì)的提取方法廣泛采用有機溶劑萃取法[8]，但僅靠溶劑浸提的方法，提取率并不高，添加果膠酶和纖維素酶，不僅加速植物體細胞壁的軟化，還有使其膨脹及崩潰的作用，促進活性物質(zhì)的溶出，從而提高得率。因此，試驗以藍莓為原料，采用復(fù)合酶輔助溶劑提取法有效提高藍莓中白藜蘆醇的提取量，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，篩選出影響含量的關(guān)鍵因素，再通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期為優(yōu)化藍莓中白藜蘆醇的提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山地區(qū)新鮮藍莓；白藜蘆醇標準品、纖維素酶、果膠酶，均購置阿拉丁試劑有限公司；甲醇、乙醇、氯化鉀、醋酸鈉、無水碳酸鈉等試劑均為分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDZ5-MS型低速多管架自動平衡離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SPF-110X12型往復(fù)式恒溫震蕩水浴培養(yǎng)搖床，上海世平實驗設(shè)備有限公司；FD-1C-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；DCY-SY12型恒溫水浴氮吹儀，浙江碩丹科技有限公司；JA1003J型分析天平，上海雷韻試驗儀器制造有限公司；101-3型電熱鼓風干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 藍莓粉的制備

新鮮藍莓榨汁后將藍莓果皮在冷凍干燥盤中均勻薄層鋪開封膜，放進-80 ℃冰箱內(nèi)冷凍24 h拿出放入冷凍干燥機中，冷凍48 h取出刮粉得到初制樣品，將樣品放置研缽中磨碎（過孔徑0.150 mm篩）得樣品備用。

1.4 樣品溶液的制備

精密稱定藍莓果皮粉末0.5 g，按料液比1∶20 g/mL添加質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)酶解溫度和酶解pH，添加適量纖維素酶與果膠酶共1.5 mg，恒溫搖床一段時間，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，分離出上清液。

1.5 樣品中白藜蘆醇含量的測定

參照師守國等[9]的方法，取50 μL待測樣品，采用與白藜蘆醇標準品測定相同方法測定吸光度。白藜蘆醇標準曲線的建立：稱取白藜蘆醇標準品5.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇作為溶劑進行定容。分別吸取溶液0，50，100，150，200，250和300 μL各置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 μg/mL的對照品溶液，以甲醇作為空白，分別測定在305 nm波長下的吸光度，以標準品濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.6 單因素試驗

1.6.1 復(fù)合酶比例的確定

取7份0.5 g藍莓粉末樣品，選擇酶解溫度為50 ℃、酶解pH為5，酶解3 h，分按表1添加復(fù)合酶（同時使用單一纖維素酶和果膠酶作為對照），酶解反應(yīng)結(jié)束后，測定白藜蘆醇的含量。

1.6.2 酶解溫度的確定

取5份0.5 g藍莓粉樣品，選擇酶解pH為5、選擇上一組酶解最佳比例、酶解時間為3 h，控制酶解溫度分別為40，45，50，55和60 ℃，提取后測定白藜蘆醇的含量。

表1 復(fù)合酶比例對含量的影響 單位：g

1.6.3 酶解時間的確定

取5份0.5 g藍莓粉樣品，選擇上一組酶解最佳溫度、酶解最佳比例、酶解pH為5.0，控制酶解時間分別為1，2，3，4和5 h，提取后測定白藜蘆醇的含量。

1.6.4 酶解pH的確定

取5份0.5 g藍莓粉樣品，選擇上一組酶解最佳時間、酶解最佳溫度以及酶解最佳比例，控制酶解pH分別為3，4，5，6和7，提取后測定白藜蘆醇的含量。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

采用Box-Behnken試驗設(shè)計，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以白藜蘆醇的含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析法進行三因素三水平的試驗設(shè)計。最后應(yīng)用Design-Expert對試驗結(jié)果進行構(gòu)圖分析，并對最優(yōu)值進行預(yù)估。

表2 因素水平表

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 24.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，檢驗各組數(shù)據(jù)的顯著性，顯著性水平選擇0.05，最后采用Design-Expert 8.0分析軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶用量的確定

由圖1可知，復(fù)合酶的效果要比單一酶好。在使用復(fù)合酶的樣品中，白藜蘆醇的含量總體上呈現(xiàn)上升的趨勢。隨著果膠酶比例的增加，細胞間的果膠質(zhì)分解速度加快，白藜蘆醇苷釋放得更多，含量逐步增加，在復(fù)合酶中，果膠酶起到主要作用。當纖維素酶：果膠酶比例為1∶5時，白藜蘆醇含量達到最大，為363.74 mg/L。綜合考慮顯著性差異，選取m（纖維素酶）∶m（果膠酶）5∶1，1∶1，1∶5 3個水平進行響應(yīng)面設(shè)計。

2.2 酶解溫度的確定

如圖2可知，隨著溫度升高，白藜蘆醇的含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在50 ℃達到最大值，白藜蘆醇含量為332.01 mg/L；當溫度超過50 ℃時，白藜蘆醇的含量開始下降。這是因為適宜的溫度下，酶的活性隨著溫度的上升而提高，細胞分解速度不斷提高，白藜蘆醇苷釋放速度加快，含量不斷提高；而溫度過高（＞50 ℃時），一方面酶在高溫下部分失活，活性受到抑制，另一方面白藜蘆醇在高溫下易分解，導致含量降低。綜合考慮，選取45，50和55 ℃ 3個水平進行響應(yīng)面設(shè)計。

圖1 不同復(fù)合酶比例對白藜蘆醇含量的影響

圖2 不同酶解溫度對白藜蘆醇含量的影響

2.3 酶解pH的確定

如圖3可知，隨著pH的增加，白藜蘆醇的含量總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。pH在3到6時，隨著pH增大，白藜蘆醇的含量呈現(xiàn)上升趨勢；當pH等于6時，白藜蘆醇的含量達到最大值，為318.77 mg/L；當pH＞6后，白藜蘆醇的含量呈現(xiàn)下降趨勢。pH對白藜蘆醇含量的影響主要原因在于pH對酶的影響。pH在3～6范圍內(nèi)時，酶的活性隨著pH增大而增強，細胞壁分解加快，白藜蘆醇含量逐漸上升；pH在6～7范圍內(nèi)，酶的活性受到抑制，細胞壁分解速度減慢，含量開始下降。綜合考慮，所以酶解pH選擇5，6，7 3個水平進行響應(yīng)面設(shè)計。

2.4 酶解時間的確定

如圖4所知，當酶解1 h后，白藜蘆醇含量趨于最大值，為314.20 mg/L。當酶解2 h時，白藜蘆醇得率趨于下降，在3 h后白藜蘆醇含量再次上升。酶解4 h后，白藜蘆醇含量趨于平緩后開始下降。這可能是由于反應(yīng)開始時，底物濃度大，復(fù)合酶可快速水解底物，白藜蘆醇含量隨著酶解時間的增加而快速提高，從而達到相對最佳提取條件。在2 h時，可能由于部分酶由于酶解環(huán)境突然變化而使得酶解反應(yīng)緩慢，而容器內(nèi)氧氣氧化白藜蘆醇，導致白藜蘆醇含量下降。在3 h時，可能酶解完全，所以在此處上升。在4～5 h，白藜蘆醇含量變化可能主要受到容器內(nèi)氧氣的影響，且隨著容器內(nèi)氧氣消耗，下降速度減緩，最終白藜蘆醇含量將趨于穩(wěn)定。為了節(jié)省時間，又因為酶解時間是相對影響因素最小的條件，故酶解時間選擇1 h。

圖3 不同酶解pH對白藜蘆醇含量的影響

圖4 不同酶解時間對白藜蘆醇含量的影響

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化藍莓白藜蘆醇提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

通過單因素試驗，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以復(fù)合酶比例、酶解溫度、酶解pH 3個因子為自變量，分別用A、B、C表示，以白藜蘆醇的含量為響應(yīng)值設(shè)計了3個因素、3個水平共17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，以隨機次序進行，重復(fù)3次獲得的響應(yīng)值均值，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

2.5.2 數(shù)據(jù)模型建立與回歸分析

利用Design-Expert 8.0軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到白藜蘆醇含量對復(fù)合酶比例（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）的回歸模型方程Y（mg/L）=342.06+23.12A+7.71B+2.40C+5.99AB+0.51AC+0.86BC+11.90A2-20.29B2-13.44C2，Y為白藜蘆醇含量的預(yù)測值。一次項系數(shù)值的大小可以反映因素對響應(yīng)值的影響程度，由回歸方程可得出提取藍莓中白藜蘆醇的主次影響因素順序為復(fù)合酶比例＞酶解溫度＞酶解pH。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.5.3 回歸模型的方差分析

從表4方差分析可以看出，該模型的p＜0.001 8＜ 0.01，表現(xiàn)為極顯著。失擬項的p=0.088 4＞0.05，表明無失擬因素存在，各因素的效應(yīng)關(guān)系為復(fù)合酶比例＞酶解溫度＞酶解pH。其校正決定系數(shù)R2（adj）=0.860 8＞0.80和變異系數(shù)（CV）為2.59%，說明此模型擬合度好，誤差小，可以用來分析和預(yù)測白藜蘆醇的含量。

表4 回歸模型方差分析

2.5.4 響應(yīng)面分析

各因素的相互關(guān)系以及相互作用程度，可以通過響應(yīng)面圖反映[10]。通過觀察響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度，可以更加直觀、清晰地觀察兩因素之間關(guān)系，當?shù)雀呔€呈圓形且坡度較平緩時，表示兩因素交互作用不顯著，呈橢圓形且坡度較陡時，表示兩因素交互作用影響顯著[11]。

從3D響應(yīng)面圖（圖5～圖7）可以看出，各個因素對白藜蘆醇提取率的影響程度。由圖5可知，酶比例曲面的變化程度比酶解溫度曲面變化更大，說明酶比例對白藜蘆醇提取率的影響更顯著；由圖7可知，酶解溫度曲面變化程度比pH曲面變化程度大，說明酶解溫度對提取率的影響較顯著，以上均與方差分析相符。圖7等高線為橢圓形狀，說明酶解溫度和pH之間交互作用顯著。

圖5 酶比例和酶解溫度交互作用

圖6 酶比例和pH的交互作用

圖7 酶解溫度與pH的交互作用

2.5.5 提取條件的優(yōu)化及驗證試驗

通過軟件回歸方程對進一步優(yōu)化，由以上結(jié)果分析得出最佳提取工藝條件為m（纖維素酶）∶m（果膠酶）=0.99∶1，酶解反應(yīng)溫度為54.69 ℃，酶解pH為5.45，酶解時間為1 h，提取白藜蘆醇質(zhì)量濃度為372.76 mg/L。同時結(jié)合實際條件，最佳工藝選取m（纖維素酶）∶m（果膠酶）=1∶1，酶解反應(yīng)溫度為55 ℃，酶解pH為5.5，酶解時間為1 h，在此條件下白藜蘆醇含量為371.79 mg/L，與預(yù)測值的相對誤差為0.26%。采用響應(yīng)面法優(yōu)化藍莓中白藜蘆醇提取工藝條件是合理可行的。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化藍莓中白藜蘆醇的提取工藝條件，得出最佳提取工藝條件：m（纖維素酶）∶m（果膠酶）=1∶1，酶解反應(yīng)溫度為55 ℃，酶解pH為5.5，酶解時間為1 h，在此條件下白藜蘆醇含量為371.79 mg/L。