響應面法優化刺梨精釀啤酒釀造工藝

李巖，姜鑫，黃劍，董小雷，劉同軍*，宋揚*

1.齊魯工業大學（山東省科學院）（濟南 250306）；2.泰山市農業農村局（泰安 271000）

我國是啤酒消費大國，精釀啤酒品種多樣，越來越受到人們的喜愛[1]。艾爾啤酒是精釀啤酒的主要種類，是使用上面發酵酵母發酵，與拉格啤酒相比具有發酵速度快、酯香濃郁、口感醇厚等特點[2]。刺梨具有很高的營養價值，富含維生素C、胡蘿卜素、葉酸、氨基酸等，其中維生素C含量有“果中之王”之稱[3-4]；刺梨還具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤和防治糖尿病等多種藥理作用[5]；金刺梨中含有的萜類化合物對多種有害菌起到抑制作用，可作為天然的食品防腐劑使用[6-7]。姚敏等[8]研究發現刺梨在發酵后VC、多酚和黃酮的保留率很高；王若琳[9]研究發現刺梨的香氣中酸香、果香、木香、青香是關鍵香韻；彭邦遠[10]研究發現對刺梨酒香味貢獻最大的是酯類和烯烴類；劉曉柱等[11]研究發現在刺梨酒制備過程中非釀酒酵母會產生甘油和酯類等物質，分泌的胞外酶會水解結合態底物，豐富刺梨汁的香味。王瑜等[12]研究發現，刺梨汁在發酵期添加可促進果實中多酚等物質的轉化和有機酸、醇類和酯類物質含量增加，這些物質成分可以增加啤酒中刺梨的風味感和層次感。刺梨在啤酒中的應用鮮有報道，近年來隨著消費升級，啤酒的中高端領域一直是中國品牌的軟肋[13]，刺梨啤酒的研究可以豐富精釀市場的多樣化。

1 材料與方法

1.1 材料

皮爾森麥芽（3.3EBC）、慕尼黑麥芽（17.7EBC）、焦香麥芽（59.1EBC）：永順泰（昌樂）麥芽有限公司；酒花Amarillo（亞麻黃）：張掖斯丹納酒花有限公司；酵母US-05：Fermentis公司；刺梨：貴州龍里新鮮刺梨，充分成熟。

1.2 儀器與設備

SPL-250恒溫箱，濟南龍瑞商貿有限公司；SWCJ-2D超凈臺，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；SD9012B EBC色度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；WYT-J手持糖度計，上海壘固儀器有限公司；YXQLS-75SII滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。50 L啤酒家釀設備，申東設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 成品啤酒理化指標分析

雙乙酰、苦味值、總酸和酒精度的測定：參考GB/T 4928—2008。

1.3.2 啤酒釀造過程及工藝要點

麥芽粉碎：78.6%皮爾森麥芽（3.3EBC）、4.9%慕尼黑麥芽（17.7EBC）、16.5%焦香麥芽（59.1EBC）混合，加水濕粉碎，粉碎原則破而不碎[14]。

刺梨汁制備：將刺梨果經去蒂、清洗、破碎后于榨汁機中按1∶1加水榨汁，所得原刺梨果汁加SO2至80 mg/L，經4 ℃過夜冷儲，去除沉淀物后備用，操作期間盡量避免果汁與空氣長時間接觸。

糖化工藝：糖化包括恒溫浸出法一段式糖化、過濾和洗糟。糖化料水比1∶3，邊攪拌邊投料避免結塊，投料結束后的醪液溫度為67 ℃，維持60 min；升溫至78 ℃，維持10 min，糖化完成。過濾前添加78 ℃的洗糟水至剛好沒過過濾篩板，糖化醪液轉移至過濾槽，麥汁在過濾槽中靜置20 min，回流后過濾，控制麥汁流出速度保證麥汁清亮，無渾濁產生。洗糟兩次，水溫控制在76～78 ℃。

麥汁煮沸工藝：麥汁煮沸時間共60 min，初沸5 min時添加30% Amarillo；煮沸20 min時添加35% Amarillo；煮沸終了前10 min添加35% Amarillo。煮沸結束后麥汁快速回旋，靜置20 min分離熱凝固物。

發酵工藝：煮沸后的麥汁用冷卻盤管降溫至20 ℃左右后把麥汁分裝到1.5 L的PET瓶中，向瓶中加入刺梨汁，在滅菌臺中添加酵母US-05，接種量為1.8×107CFU/mL，然后用無菌封口膜封口，保證透氣并防止雜菌進入，操作期間避免染菌。

后貯：當麥汁的殘糖降到5.0～6.0 °P時封蓋進行后熟，直到雙乙酰的含量＜0.1 mg/L時再用培養箱給麥汁降溫，期間先以1.5 ℃/h降溫至4 ℃并維持24 h，刺梨汁在4 ℃條件下貯藏能更好地釋放其主要的揮發性物質[15]。將發酵瓶轉移至冰箱，以1 ℃/h降溫至0.5 ℃左右，刺梨啤酒在0.5 ℃左右貯酒5～7 d，酒體基本成熟，進行風味物質的分析。

1.3.3 單因素試驗

采用單因素控制變量法考察原麥汁濃度（10，11，12，13和14 °P）、發酵溫度（16，18，20，22和24 ℃）和刺梨汁添加量（2%，5%，10%，20%和40%）對刺梨啤酒理化指標及感官評分的影響。

1.3.4 響應面試驗優化釀造工藝

在單因素試驗結果基礎上，采用Box-Behnken方案設計三因素三水平的響應面試驗，確定最優方案配比。設A（原麥汁濃度）、B（發酵溫度）和C（刺梨汁添加量）為自變量，感官品評分數為響應值（Y），響應面分析包括響應面二次模型的方差分析及擬合分析，各因素及其水平取值見表1，設計方案中，每個試驗組都重復3次，取其均值。試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.3.5 啤酒的感官品評標準

按照少量多次原則，對酒進行重復的盲測[16]。由8名感官品評專家進行感官品評，對啤酒的泡沫、外觀、香氣（刺梨香，麥芽香及酯香）和口味進行綜合評分，滿分為100分，分數評分標準見表2。

1.3.6 發酵罐放大試驗

用最優工藝進行50 L發酵罐放大試驗，以不加刺梨汁作為對照，進行感官品評分析和理化指標分析。對啤酒中描述的3種香味（刺梨果香，麥芽香，酯香）、4種口感特征（酸味，甜味，苦味，澀味）和2種酒體特征（味道持久性，酒體飽滿性）進行打分，分數范圍為0～5分。

表2 感官評價標準

2 結果與分析

2.1 單因素試驗優化結果

由圖1可知，隨著原麥汁濃度的升高，感官品評分先升高后降低，酒精度持續升高。發酵醪液中的原麥汁濃度與酵母細胞活力及其發酵性能有關，因此原麥汁濃度低時酵母活性不足，發酵乏力，產生的風味物質少，導致感官品評分數低；隨著原麥汁濃度的升高，酵母活性增強，發酵產生的香味物質更多，酒精度越高，其感官品評分更高[17]；原麥汁濃度過高時不利于突出刺梨的風味，而且過高的酒精度會使啤酒過于厚重，因此感官評分降低。由圖1可知，原麥汁濃度12 °P合適，以此為響應面中心點。

圖1 原麥汁濃度和對啤酒品質的影響

由圖2可知，隨著發酵溫度的升高，感官品評分先升高后降低；酒精度持續升高，在發酵溫度為22 ℃時不再增加。發酵溫度較低時，酵母發酵速度緩慢，產生的酯香味淡薄；當發酵溫度為高時，酵母代謝能力增強，發酵速度快，產生副產物高級醇等含量高[18]，產酒精能力增強，對整體口感影響大。由圖2可知，發酵溫度20 ℃合適，并以此為響應面中心點。

圖2 發酵溫度對啤酒品質的影響

由圖3可知，隨著刺梨汁添加量的升高，感官品評分持續升高，在添加量為20%時才緩慢降低；酒精度持續降低。刺梨汁添加量直接關系到刺梨風味物質的產生，添加太少刺梨風味不明顯，過多則影響啤酒風味的協調性。刺梨汁添加量關系到發酵液中的氨基氮含量，氨基氮的缺乏能夠影響酵母發酵的速率，酯類和脂肪酸等香味化合物的產生，并且還會產生過多的H2S異味[19-20]，而麥汁中的氨基氮含量最多，發酵醪液中麥汁的比例少就無法給酵母提供足夠的氨基氮，因此會影響感官評分；酵母活性不夠，產酒精能力明顯下降。由圖3可知，刺梨汁添加量在20%時最合適，以此為響應面中心點。

圖3 刺梨汁添加量對啤酒品質的影響

2.2 響應面優化試驗結果

根據Box-Behnken設計方案進一步優化了原麥汁濃度、發酵溫度和刺梨汁添加量，所得試驗結果見表3。

根據Design-Expert 10軟件設計方案對試驗數據處理，得到多元二次回歸方程模型（感官評分=93.53+0.86A+0.92B-1.82C-0.36AB+0.36AC+1.03BC-2.37A2-3.05B2-4.67C2）并對該模型進行方差分析及擬合分析見表4。

由表4可知，3個因素的影響大小為C＞B＞A；一次項C及二次項A2、B2、C2對感官評分的影響極顯著（p＜0.01）；一次項A、B和交互項BC對結果影響顯著（p＜0.05）；交互項AB、AC對結果影響不顯著（p＞0.05）；失擬項為0.050 8＞0.05，表示失擬項不顯著，則該試驗的失擬度好，該模型可以對試驗結果做出準確的預測和分析；模型p＜0.000 1，表示該模型極顯著[21]。

表3 Box-Behnken試驗設計與結果

表4 響應面二次模型的方差分析和擬合分析

相關系數R2=0.981 5，越接近于1表明相關性越好，試驗誤差小；（R2adj-R2pred）＜0.3，表明這兩個值較接近，此模型適合該工藝過程；CV=0.86%＜ 1%，說明此試驗的精確度和試驗的重復性高；信噪比為19.705＞4，表明所建立的模型擬合精度好，可用于優化原麥汁濃度、發酵溫度和刺梨汁添加量對感官評分影響的分析[22]。

采用Design-Expert 10軟件根據回歸方程繪制響應面圖及其等高線，見圖4。

圖4 原麥汁濃度、發酵溫度及刺梨汁添加量的交互作用對感官評分影響的響應面和等高線

圖4顯示了每個因素兩兩交互的影響，而其余因素則保持在中心水平。各因素之間的交互作用可以由等高線反映出來，等高線越趨近于橢圓形則兩因素之間交互作用明顯，反之越不明顯[23]。由圖4可知，感官評分隨著發酵溫度和刺梨添加量的升高先上升后下降，等高線呈橢圓形說明其交互作用顯著，與表4中p值分析結果一致；響應面的斜率較高，表明感官評分對自變量因素的變化較為敏感[24]。

由響應面的分析可知，刺梨啤酒最佳發酵工藝條件為原麥汁濃度12.32 °P、發酵溫度20.25 ℃和刺梨汁添加量26.28%，在此最優條件下，感官評分為90.78分。為了便于實際操作，將工藝條件修訂為原麥汁濃度12 °P、發酵溫度20 ℃和刺梨汁添加量26%。

2.3 感官分析

用最優工藝進行50 L發酵罐放大試驗，并以不加刺梨汁作為對照，感官品評結果見圖5。

圖5 感官評價分析

由圖5可知，刺梨啤酒與對照組相比具有明顯的刺梨果香，并且持久性好，麥芽香與果香相輔相成，表現出協調的香氣。試驗組澀味和酒體飽滿性較對照組高，可能是因為刺梨果汁含有單寧、多酚及其衍生物，如單寧會給予啤酒澀感，使酒體更加渾厚[8]。試驗組酸味和甜味較平衡，酯香味較對照組差，可能是因為試驗組中麥汁含量多對酵母發酵更有利，因此產香越多。綜合比較，刺梨啤酒具有更好的表現。

2.4 啤酒理化指標分析

以最優工藝進行50 L發酵罐放大試驗，結果理化指標見表5。

表5 刺梨啤酒理化指標

對優化后的刺梨啤酒進行理化指標分析，結果表明，酒精度5.4%vol，苦味值15 IBU，色度17.1 EBC，總酸1.74 mL·100 mL-1，雙乙酰0.06 mg·L-1。參考GB/T 4927—2008《啤酒》，其色度、色雙乙酰、酒精度等均符合國家標準。

3 結論

研究采用單因素試驗和響應面法分析對刺梨啤酒釀造工藝條件進行了優化。結果表明，刺梨汁添加量對刺梨啤酒品質影響最大，釀造工藝的最佳參數為：原麥汁濃度12 °P，發酵溫度20 ℃和刺梨汁添加量26%，感官評分為90.78分。以最優條件進行放大試驗并進行理化指標的檢測，所釀刺梨啤酒符合GB/T 4927—2008《啤酒》的國家標準，啤酒外觀清亮，泡沫豐富細膩，殺口力強，口感協調，有明顯的酒花香和刺梨果香；該研究為刺梨啤酒的發酵生產可行性提供了理論和實踐基礎，對刺梨的有效利用有重要的指導意義。