胰蛋白酶酶解養殖大黃魚脫脂魚卵蛋白的工藝

周靜，李惠芳，梁鵬, ，陳麗嬌，程文健

1.福建農林大學食品科學學院（福州 350002）；2.福建省食品藥品質量檢驗研究院（福州 350000）；3.福建省海洋生物技術重點實驗室（福州 350002）

大黃魚（Large yellow croaker，Pseudosciaena crocea）又稱黃花魚、黃瓜魚、黃魚等[1]。由2019年《中國漁業統計年鑒》可知，我國大黃魚海水養殖的產量已達到197 980 t，其中福建省產量為165 378 t，占到全國產量的83.5%[2]。大黃魚營養成分如蛋白質、不飽和脂肪酸等含量高，且通過簡單的烹飪手法就可以得到佳肴[3]，因此在市場上很受追捧。大黃魚魚卵是大黃魚加工過程中的主要副產物，其占魚體總質量的15%～25%[4]。魚卵中的蛋白質和脂肪含量都較高，如黑龍江茴魚鮮魚卵[5]和史氏鱘魚鮮魚卵[6]。此外還富含各種必需氨基酸等多種營養素[7]。

近年來對于水產食品加工副產物的利用研究越來越多，目前來說，對于魚卵的加工方式主要還是不同種類的腌制。而傳統的腌制過程不但會使魚中的營養物質流失，還會生成對人體有危害的生物胺和亞硝酸鹽等有毒物質[8-9]。因此有必要開發健康的魚卵產品來滿足市場需求以及避免原料的浪費。課題組前期采用響應面法優化了酶法以及乙醇提取法提取大黃魚魚卵油的工藝[10-11]，通過噴霧干燥法將大黃魚魚卵油制備成微膠囊并表征其性質[12]。課題組所進行的研究都表明大黃魚魚卵具有優良的加工利用價值。

此次試驗以水解度和蛋白回收率作為檢驗指標，用胰蛋白酶酶解養殖大黃魚脫脂魚卵，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化酶解工藝，以期通過酶解獲得大黃魚脫脂魚卵蛋白肽，為豐富魚卵加工形式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

養殖大黃魚脫脂魚卵；胰蛋白酶1∶250，酶活為5.0萬 U/g；其他試劑均為分析純。

K9840自動凱氏定氮儀、SH220N石墨消解儀，濟南海能儀器股份有限公司；TGL-16臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；BS 224S型電子分析天平、PB-10型pH計，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HH系列數顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

脫油脫脂魚卵→酶解→滅酶（水浴鍋中水浴15 min進行滅酶，溫度為85 ℃）→酶解液→離心（離心機中離心20 min，轉速為4 000 r/min）→上清液→測定相關指標

1.2.2 主要成分測定

水分、蛋白質、粗脂肪的測定方法參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》[13]中的直接干燥法、GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》[14]中的凱氏定氮法，以及GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》[15]中的索氏提取法。

1.2.3 水解度測定

氨基氮的含量和總氮的量分別采用甲醛滴定法和凱氏定氮法。水解度按式（1）計算。

1.2.4 蛋白回收率測定

將酶解液放置于室溫條件下冷卻，后放入轉速為4 000 r/min的離心機中進行離心20 min，從而得到上清液。采用凱氏定氮法測定其總氮含量。蛋白回收的按式（2）計算。

1.3 胰蛋白酶酶解工藝研究

1.3.1 單因素試驗

1) 酶添加量的確定。在pH 7.5±0.1、酶解溫度50 ℃、料液比1∶10（g/mL）的條件下，將酶解液酶解4 h，并利用式（1）和（2）計算出水解度和蛋白回收率。

2) 酶解時間的確定。在酶添加量5 000 U/g、酶解溫度50 ℃、pH 7.5±0.1、料液比1∶10（g/mL）的條件下，設置酶解1，2，3，4，5和6 h，以酶解大黃魚脫脂魚卵，從而確定最佳酶解時間。

3) 酶解溫度的確定。在胰蛋白酶添加量5 000 U/g、pH 7.5±0.1、料液比1∶10（g/mL）、酶解時間4 h的條件下，設置酶解溫度25，30，35，40，45，50，55，60和65 ℃，以酶解大黃魚脫脂魚卵，從而確定最佳酶解溫度。

4) 料液比的確定。在胰蛋白酶添加量5 000 U/g、pH 7.5±0.1、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h的條件下，設置料液比1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶10，1∶13，1∶16和1∶19（g/mL），以酶解大黃魚脫脂魚卵，從而確定最佳酶解料液比。

5) pH的確定。在胰蛋白酶添加量5 000 U/g、酶解溫度50 ℃、料液比1∶7（g/mL）、酶解時間4 h的條件下，設置酶解pH 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0，以酶解大黃魚脫脂魚卵，從而確定最佳酶解pH。

以上試驗所用的魚均為干基。每組做3次試驗，結果取3次試驗的平均值。

1.3.2 正交試驗

胰蛋白酶酶解正交試驗因素及水平如表1所示。

表1 胰蛋白酶酶解正交試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 胰蛋白酶酶解工藝優化分析

2.1.1 酶添加量的確定

如圖1所示，當胰蛋白酶的量超過5 000 U/g時，水解度降低。原因可能是反應中胰蛋白酶的濃度達到過飽和狀態，由此反應變慢[16]。當酶添加量為6 000 U/g時，蛋白回收率達到最大。因此酶添加量選擇5 000 U/g。

圖1 酶添加量的影響

2.1.2 酶解時間的確定

如圖2所示，超過4 h可以看到水解度逐漸降低，其原因存在3種情況：一是隨著反應的進行，胰蛋白酶逐漸失活；二是反應產物在反應體系中不斷堆積，使得整體反應被抑制；三是因為底物被耗盡[17]。并且超過4 h后，蛋白回收率也處于下降趨勢。因此酶解時間選擇4 h。

圖2 酶解時間影響

2.1.3 酶解溫度的確定

如圖3所示，當溫度超過50 ℃時，水解度開始下降。原因可能是溫度過高導致胰蛋白酶的變性或者失活，有活性的胰蛋白酶減少，反應速率由此下降[18]。此外，蛋白回收率的峰值在溫度45 ℃時到達。由于溫度對水解度的影響更大，因此酶解溫度選擇50 ℃。

圖3 酶解溫度的影響

2.1.4 料液比的確定

如圖4所示，隨著料液比的增加，水解度呈先上升后下降的趨勢，料液比較低時，反應物黏度較高，接觸面積有限，反應被制約；隨著料液比的增加，體系中反應物的濃度下降，酶解反應速率降低，水解度隨之下降[19-20]。而蛋白回收率也在料液比為1∶7（g/mL）達到最大。綜上所述，選擇1∶7（g/mL）為最適酶解料液比。

2.1.5 pH的確定

如圖5所示，隨著pH的增加，當pH超過7.0后，水解度開始出現明顯的下降。蛋白回收率也呈現先上升后下降的趨勢。原因可能是反應環境酸堿性的變化導致胰蛋白酶的結構被破壞，有活性的胰蛋白酶含量較少，反應速度減慢，導致水解度和蛋白回收率也相應降低。因此，選擇pH 7為最適反應pH。

圖4 料液比的影響

圖5 pH的影響

2.2 正交試驗結果分析

由表2可知，5個因素在胰蛋白酶酶解過程中對水解度的影響順序依次為料液比＞酶解溫度＞酶解時間＞pH＞酶添加量，其中C、D、E三個因素的R值均超過1，即對胰蛋白酶的酶解效果有較大影響。由表2中K值可知，最優水平為A2B2C5D2E3，即pH為7.5、酶添加量為4 500 U/g、料液比為1∶9（g/mL）、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為4 h。此時水解度可以達到14.09%。

表2 正交試驗結果

接表2

3 結論

此次試驗通過單因素試驗得出胰蛋白酶酶解大黃魚魚卵的pH在7.5時，蛋白回收率達到最大值；酶添加量在5 000 U/g時最為適宜；綜合蛋白回收率和水解度2個指標以及成本考慮，選擇4 h為最佳酶解時間，50 ℃為最佳酶解溫度。此外，對試驗進行正交優化，從而得到最佳工藝。由此為大黃魚魚卵酶解提供了較為理想化的試驗數據，有利于大黃魚魚卵副產品的開發與利用。