正交試驗(yàn)法優(yōu)化瑪咖多糖含量的測(cè)試方法

楊秀峰，魏金超，高玉梅，陳芮*

1.云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院（昆明 650500）；2.中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所（北京 100190）

瑪咖（學(xué)名為L(zhǎng)epidium meyeniiWalp，西班牙語又稱Maca）是一種原產(chǎn)于南美洲的十字花科植物，現(xiàn)已成功引種于中國(guó)云南、新疆、西藏等地區(qū)[1]。瑪咖作為一種純天然食品，富含高單位營(yíng)養(yǎng)素，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身的功效。Dini等[2]曾報(bào)道瑪咖干根中含有的功效成分為多糖、生物堿、芥子油苷及多酚類物質(zhì)等。研究發(fā)現(xiàn)：瑪咖中還含有兩種次生代謝物——瑪咖酰胺和瑪咖烯，它們是瑪咖中特有的活性成分[3-4]。此外，瑪咖還具有抗疲勞[5]、增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[6]、抗氧化及提高生育能力等功效[7]。

多糖是由超過10個(gè)單糖的糖苷鍵結(jié)合成糖鏈而形成的高分子碳水化合物，是一種廣泛存在于高等植物、動(dòng)物細(xì)胞膜、微生物的細(xì)胞壁中的天然大分子物質(zhì)，也是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一[8]?，斂Ф嗵亲鳛楝斂е械挠行С煞种?，具有抗腫瘤、提高生育能力、降血糖等作用[9]，此外還具有重要的生物活性，如較強(qiáng)的自由基清除能力[10-12]，對(duì)酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷及環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠具有保護(hù)作用[13-14]；抗疲勞活性[15]及增強(qiáng)免疫活性等[16-17]?，斂Ф嗵且?yàn)槠鋬?yōu)異的生物活性已受到眾多學(xué)者的青睞。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多糖的提取技術(shù)越來越多樣化，從最傳統(tǒng)的溶劑萃取法發(fā)展到酶法，隨后引入超聲輔助法和微波輔助法[18-20]，再到超臨界萃取技術(shù)的應(yīng)用[21]。對(duì)于瑪咖多糖，傳統(tǒng)的提取方法為熱水、堿水和酸水浸提法等，研究報(bào)道超聲輔助提取和三相萃取法等提取手段也被應(yīng)用于瑪咖多糖的提取[22-24]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法能夠?qū)崿F(xiàn)以最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到與大量全面試驗(yàn)等效的結(jié)果，因此被認(rèn)為是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的多因素多水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。擬用水提法來測(cè)定瑪咖中多糖的含量。在單因素研究的基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)瑪咖中多糖的提取過程進(jìn)行優(yōu)化。

1 試劑與儀器

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用的試劑均為分析純；麗江瑪咖，云南省昆明市豐熙茶行提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000s型紫外-可見分光光度計(jì)，上海菁海儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 瑪咖多糖的提取過程

瑪咖干粉→水浴提取→離心分離，收集上清液→熱水洗滌沉淀，收集上清液→合并上清液→多糖含量的計(jì)算

2.2 葡萄糖儲(chǔ)備液的配制

精確稱取0.010 0 g葡萄糖，用水溶解后定容至100 mL，配制成0.100 mg/mL的葡萄糖儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 瑪咖干粉中多糖含量的計(jì)算

多糖含量采用苯酚-硫酸法[25]測(cè)定，結(jié)合葡萄糖溶液工作曲線按照（1）計(jì)算：

式中：W為試樣的質(zhì)量，mg；C為葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；D為稀釋因子；F為換算因子。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳波長(zhǎng)的選擇

吸取1 mL葡萄糖儲(chǔ)備液，補(bǔ)充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚，迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，冷水中冷卻。以蒸餾水為空白對(duì)照，于300～600 nm測(cè)定吸光度。該溶液在此范圍內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)即為測(cè)定樣品的最佳波長(zhǎng)。由圖1可知，樣品在300～600 nm處出現(xiàn)了2個(gè)吸收峰，對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)分別為325和490 nm。490 nm對(duì)應(yīng)的吸收峰的強(qiáng)度明顯地強(qiáng)于325 nm的吸收峰，故試驗(yàn)選擇490 nm為測(cè)定的最佳波長(zhǎng)。這一試驗(yàn)結(jié)果與王金全[26]在瑪咖多糖提取工藝的研究試驗(yàn)中選擇的最佳波長(zhǎng)一致。

圖1 0.100 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見吸收光譜圖

3.2 儀器精密度試驗(yàn)

吸取6份葡萄糖儲(chǔ)備液于10 mL比色管中，利用苯酚-硫酸法測(cè)量吸光度檢測(cè)所用紫外-可見吸收光譜儀的精密度。如表1所示，平行試驗(yàn)6次，測(cè)得葡萄糖溶液在490 nm的吸光度無明顯變化，δRSD為2.04%。這一結(jié)果表明試驗(yàn)所用儀器精密度良好。

表1 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3.3 工作曲線的繪制

分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL葡萄糖儲(chǔ)備液，配制過程同最佳波長(zhǎng)的選擇所用溶液的配制過程。測(cè)定490 nm的吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。如圖2所示，在0.02～0.06 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性回歸方程為A=14.616 7C+0.046 21，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。結(jié)果表明：在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的性線關(guān)系。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線

3.4 換算因子的測(cè)定

稱取0.010 0 g干燥至恒質(zhì)量的瑪咖多糖，溶解并定容至100 mL。吸取2 mL于10 mL比色管中，加入1 mL 6%的苯酚溶液，加入5 mL濃硫酸，煮沸15 min后于冷水中冷卻，在490 nm下測(cè)定吸光度，按照（2）計(jì)算換算因子。

式中：F為換算因子；W為試樣的質(zhì)量，mg；C為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；D為稀釋因子。

3.5 瑪咖多糖提取工藝的評(píng)價(jià)

試驗(yàn)首先以料液比、提取溫度、提取時(shí)間為單因素，分別研究其對(duì)瑪咖多糖含量的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、料液比、時(shí)間進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)以確定測(cè)定過程中所需瑪咖多糖提取的最佳條件。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平如表2所示。

3.5.1 單因素試驗(yàn)

3.5.1.1 料液比對(duì)多糖含量的影響

稱取1 g瑪咖干粉，按照料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），在70 ℃下，提取1 h，離心分離收集上清液，沉淀用熱水洗滌一次，離心收集上清液，合并兩次上清液，并定容至250 mL。移取0.5 mL此溶液定容至10 mL。從中取1 mL溶液于10 mL比色管中，并補(bǔ)充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚溶液，加入5 mL濃硫酸，煮沸15 min后冷卻，在490 nm測(cè)定吸光度。結(jié)合式（1）和（2）計(jì)算多糖含量。由圖3可知：瑪咖多糖含量先隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比增加到1∶30（g/mL）時(shí)，含量最大；隨后隨著料液比的增加，含量又逐漸減小。這種現(xiàn)象可歸為由于提取溶劑過少，提取不充分導(dǎo)致多糖含量較低；但溶劑過多將會(huì)使樣品濃度降低，不利于多糖提取，并且過多的溶劑會(huì)帶來后續(xù)溶劑回收成本過高的問題。因此，瑪咖多糖提取的最佳料液比應(yīng)控制在1∶30（g/mL）左右。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表

圖3 料液比對(duì)瑪咖多糖含量的影響

3.5.1.2 提取溫度對(duì)多糖含量的影響

稱取1 g瑪咖干粉，在40，50，60，70和80 ℃，料液比1∶30（g/mL）條件下，提取1 h。后續(xù)操作同3.5.1.1?，斂Ф嗵堑暮颗c溫度的關(guān)系如圖4所示。瑪咖多糖含量隨著溫度的升高，先上升后下降，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)闇囟仍礁?，多糖越容易進(jìn)入水相從而使瑪咖多糖的含量升高；當(dāng)溫度超過某一值后，不但會(huì)引起多糖與其他物質(zhì)之間的有機(jī)反應(yīng)，還會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，使多糖含量下降。故測(cè)定瑪咖多糖含量時(shí)，提取瑪咖多糖的最佳溫度為50 ℃。這一結(jié)論與王金全[26]通過水提法優(yōu)化瑪咖多糖工藝試驗(yàn)中采用的溫度一致。

3.5.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響

稱取1 g瑪咖干粉，料液比1∶30（g/mL），在50 ℃分別提取0.5，1，1.5，2和2.5 h。其余操作按3.5.1.1項(xiàng)進(jìn)行，計(jì)算多糖的含量。如圖5所示：瑪咖多糖含量會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減小，當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到1 h時(shí)，含量最大。這是因?yàn)樵谝欢ǖ牧弦罕群吞崛r(shí)間下，體系會(huì)達(dá)到提取平衡，含量將會(huì)在平衡值附近波動(dòng)，而不再增加。因此，測(cè)定瑪咖多糖含量時(shí)，瑪咖多糖提取的最佳時(shí)間為1 h。

圖4 溫度對(duì)瑪咖多糖含量的影響

圖5 時(shí)間對(duì)瑪咖多糖含量的影響

3.5.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及極差分析如表3所示。對(duì)瑪咖多糖含量影響最大的因素是溫度，時(shí)間次之，最小的是料液比，即影響程度依次為提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）＞料液比（B）。測(cè)定瑪咖多糖含量時(shí)，提取瑪咖多糖的最佳工藝條件組合為A2B3C2，也就是溫度50 ℃，料液比為1∶40（g/mL），提取時(shí)間1 h。

表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

稱取1 g的瑪咖干粉，在50 ℃、料液比1∶40（g/mL）的條件下浸提1 h，后續(xù)操作同3.5.1.1。此時(shí)，測(cè)得瑪咖多糖含量為18.97%，高于表中最大含量。在此條件下得到的瑪咖多糖的含量與徐娟等[27]利用超聲輔助法在最佳工藝下提取黑瑪咖多糖的含量9.03%相比，有顯著的提高。故該方法可認(rèn)為是提取瑪咖多糖的有效方法。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取1 g瑪咖干粉，在最佳條件下提取、離心分離收集上清液，沉淀用熱水洗滌，離心收集上清液，合并兩次上清液，并定容至250 mL。吸取1 mL于10 mL比色管中，補(bǔ)充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚，迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，冷水中冷卻。以蒸餾水為空白對(duì)照，分別于0，2，6，18和24 h在490 nm測(cè)量吸光度，結(jié)果見表4。在24 h內(nèi)，試驗(yàn)樣品溶液的吸光度無明顯變化，δRSD為2.53%，說明采用該法得到的瑪咖多糖具有良好的穩(wěn)定性。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取1 g瑪咖粉末，操作同3.6。分別精密吸取1.00 mL此溶液于4支10 mL比色管中，一支加入1 mL蒸餾水，其余3支分別加入100 μL 0.10，0.050和0.025 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并補(bǔ)充水分至2 mL后，按3.6項(xiàng)方法操作，平行試驗(yàn)3次，按照式（3）計(jì)算加標(biāo)回收率。

如表5所示，該方法回收率在104.00%～118.60%之間，平均回收率為109.67%，δRSD為7.14%，說明該測(cè)定方法準(zhǔn)確率高，可用于瑪咖中多糖含量的測(cè)定。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

4 結(jié)論

試驗(yàn)用苯酚?硫酸法測(cè)定瑪咖多糖的含量。采用水提法，以料液比、提取溫度、提取時(shí)間為單因素，分別研究其對(duì)瑪咖多糖含量的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)一步得到了測(cè)定瑪咖多糖含量時(shí)提取的最佳條件。結(jié)果表明：這3個(gè)因素對(duì)瑪咖多糖含量影響大小為溫度（A）＞時(shí)間（C）＞料液比（B）；料液比1∶40（g/mL），在50 ℃提取1 h，瑪咖多糖的含量最高，可達(dá)18.97%。試驗(yàn)證明：所用的紫外-可見分光光度計(jì)精密度良好，該法得到的瑪咖多糖的穩(wěn)定性好，回收結(jié)果也令人滿意。鑒于水提取瑪咖多糖具有多糖含量高、省時(shí)、技術(shù)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此認(rèn)為這種方法也可以作為提取瑪咖多糖的有效方法。