發酵法制備刺梨果渣膳食纖維工藝研究及氨基酸分析

張想，李立郎，楊娟*，楊小生，廖秀，沈曼筠

1.貴州大學釀酒與食品工程學院（貴陽 550025）；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室（貴陽 550014）

刺梨（Rosa roxbughiiTratt）是薔薇科薔薇屬多年落葉灌木繅絲花的果實[1]，原產于中國西南地區[2]。刺梨含有多糖、維生素、膳食纖維、有機酸及各種人體必需的氨基酸、微量元素等，且具有抗氧化、抗癌防癌，降血糖、降血脂、健胃等藥用價值[3-5]。在刺梨的食品加工過程中有近50%的殘渣被丟棄[6]，造成嚴重的資源浪費。刺梨果渣中含有豐富的粗蛋白、維生素和粗纖維等[7]，有很高的再利用價值。膳食纖維（DF）被稱為“第七大營養素”[8]，因具有抗癌、抗氧化、降低膽固醇、改善胃腸健康、預防心血管疾病等作用[9-12]而備受關注。

膳食纖維的提取方法主要有化學法、酶法、物理法、發酵法等[13]。其中，微生物發酵法對可溶性膳食纖維有較好的改性效果[14]，且具有易操作、成本低、污染小、得率高等優點[15]。平菇類木腐菌能產生一些多酚氧化酶和纖維素酶來降解刺梨果渣中的木質纖維作為自身碳源，刺梨果渣含有大量有機酸物質，pH呈弱酸性，適用于平菇等木腐菌類生長[16]，其中的粗蛋白、糖類和粗纖維等物質可作為真菌生長所必備的氮源和碳源[17]。

為實現刺梨果渣高值化利用，試驗以刺梨果渣為原料，以平菇為發酵菌種，采用單因素結合響應面優化法[18]，探究平菇發酵提取刺梨果渣中膳食纖維的最佳工藝參數，旨在提高刺梨果渣中膳食纖維含量；通過氨基酸自動分析儀檢測最佳發酵工藝處理前后的氨基酸含量變化，為更好地開發利用高質量功能產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果渣（貴州恒力源天然生物科技有限公司提供，新鮮刺梨經榨汁等加工后的副產物，干燥處理后備用）；平菇一級種（貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室）；體積分數95%乙醇、CaCl2、KCl、丙酮（天津市致遠化學試劑有限公司）；α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、MES-TRIS（大連美侖生物科技有限公司）。

PDA培養基[19]：200 g馬鈴薯切片，加熱煮沸，過濾，加入20 g葡萄糖和18 g瓊脂，再次加熱煮沸10 min，調整體積至1 L后用玻璃棒攪拌溶化均勻后分裝試管，在121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌30 min，冷凝后待用。

1.2 儀器與設備

L-8800全自動氨基酸分析儀（日本HITICHI公司）；DK-98-II恒溫振蕩水浴箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA2004N分析天平（上海菁海儀器有限公司）；SX2-4-10TZ馬弗爐（廈門儀宸科技有限公司）；101-2A烘箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BZF-50真空干燥箱（常州諾基儀器有限公司）；FE20 pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LDZV-75KBS不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

在無菌條件下將保藏良好的平菇菌種母種接種到制備好的PDA斜面固體培養基上，于28 ℃恒溫培養箱種恒溫培養5～7 d，采用上述方法活化3次。

1.3.2 工藝流程

新鮮刺梨果渣→調料混勻、配制發酵培養基→裝瓶、滅菌（121 ℃，30 min）→冷卻后接入活化好的平菇菌種→發酵培養（26 ℃條件下，培養至菌絲體長滿培養基即為發酵完全）→滅菌→烘干→粉碎（過孔徑0.074 mm篩）→平菇發酵刺梨果渣膳食纖維測定

1.3.3 單因素試驗

參照1.3.2的膳食纖維提取工藝流程，選取氯化鈣添加量、氯化鉀添加量、糖含添加量、液料比4個因素進行試驗，以刺梨果渣膳食纖維得率為指標，研究平菇發酵在不同條件下對刺梨果渣膳食纖維得率的影響，單因素試驗設計（見表1）。

表1 刺梨果渣膳食纖維單因素試驗水平表

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，運用Design-Expert 8.06軟件中的Box-Behnken試驗設計方法，選擇氯化鈣添加量（A）、氯化鈣添加量（B）、糖添加量（C）、液料比（D）為自變量，平菇發酵SDF得率為響應值進行Box-Behnken響應面試驗設計，各因素的3個水平采用-1，0和1進行編碼，見表2。

表2 響應面因素及編碼水平

1.3.5 刺梨果渣膳食纖維提取率的測定

根據GB 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》中所示的酶重量法對原料的總膳食纖維（TDF）含量、不溶性膳食纖維（IDF）含量及可溶性膳食纖維（SDF）含量進行測定。

1.3.6 氨基酸的測定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，準確稱取1.000 0 g樣品，加入10 mL的6 mol/L鹽酸于水解管中，在充氮氣狀態下封口，將已封口的水解管放在110±1 ℃的恒溫干燥箱內，水解22 h后，取出冷卻至室溫。打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉移到50 mL容量瓶內，用1.0 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液溶解，振蕩混勻后過0.22 μm濾膜后，轉移至儀器進樣瓶，為樣品測定液?；旌习被針藴使ぷ饕汉蜆悠窚y定液分別以相同體積注入氨基酸分析儀，以外標法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸的濃度。

1.4 數據分析及處理

數據以x±SD表示，利用Excel 2018進行標準曲線，應用SPSS 21.0軟件進行差異顯著性分析，以p＜ 0.05為差異顯著，Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 氯化鈣（CaCl2）添加量對平菇發酵刺梨果渣DF得率的影響

由圖1可知，氯化鈣添加量0.6%～1.0%時IDF得率逐漸上升，1.0%時達到最大；之后IDF得率逐漸減小；隨著氯化鈣添加量增加，SDF得率均呈逐漸增加趨勢；氯化鈣添加量達到1%時，SDF得率達到最大值；繼續增加其含量，SDF得率反而都下降。不同濃度的鈣離子對食用菌菌絲生長有著不同程度影響[20]，鈣離子可以促進平菇菌絲生長，因菌絲體生長速度、數量增加，SDF得率逐漸增加。但隨著鈣離子濃度增高，菌絲體對鈣的吸收率降低，菌絲生長受到抑制，導致SDF得率降低，故采用平菇發酵刺梨果渣氯化鈣最佳添加量均為1.0%。

圖1 CaCl2添加量對平菇發酵刺梨果渣DF得率的影響

2.1.2 氯化鉀（KCl）添加量對平菇發酵刺梨果渣DF的影響

鉀元素是真菌生命活動不可缺少的營養物質之一[21]，在調節代謝、維持離子穩態、調節滲透壓等眾多生命過程中發揮重要作用[22-23]。由圖2可知，氯化鉀添加量對IDF的得率影響作用不大。氯化鉀添加量小于0.6%時，菌絲的生長受到抑制作用；而在氯化鉀添加量0.6%時SDF得率均為最大值；培養基中鉀離子濃度過高會導致菌絲細胞內外滲透壓和酸堿平衡失調，所以SDF得率隨著氯化鉀添加量增加而降低。故采用平菇發酵刺梨果渣氯化鉀最佳添加量均為0.6%。

圖2 KCl添加量對平菇發酵刺梨果渣DF得率的影響

2.1.3 糖添加量對平菇發酵刺梨果渣DF的影響

菌種生長過程中受到碳源、氮源種類及濃度等因素影響[24]。由圖3可知，糖添加量4%時，IDF得率均達到最高值；糖添加量超過4%時，IDF提取率隨糖添加量升高而減小；糖添加量在2%～4%范圍內，由于培養基中碳源增加，有利于菌種生長發育，SDF得率得以提高；糖添加量4%時SDF得率均得到最大值；繼續增大糖添加量，導致培養基內碳氮比例失調，引起菌絲停止生長或生長緩慢，故SDF得率逐漸降低。因此采用平菇發酵刺梨果渣糖最佳添加量均為4.0%。

圖3 糖添加量對平菇發酵刺梨果渣DF的影響

2.1.4 液料比對平菇發酵刺梨果渣DF得率的影響

在提取過程中適當的液料比能在細胞內外形成較大的濃度差，有利于DF的溶出，但是過高的液料比會阻礙DF的溶出，而過低的液料比不利于溶出[25]。由圖4可知，刺梨果渣IDF得率隨液料比增加而變大，液料比為7∶1（mL/g）時達到最大值，此后IDF得率呈下降趨勢。液料比＜7∶1（mL/g）時，不利于菌種發酵，SDF提取不完全，得率較低；液料比為7∶1（mL/g）時，SDF得率都達到最高值；液料比繼續增加，由于刺梨果渣中SDF含量有限，故溶出率不再增加。因此，采用平菇發酵刺梨果渣最佳液料比均為7∶1（mL/g）。

圖4 液料比對平菇發酵刺梨果渣DF得率的影響

2.2 Box-Behnken試驗設計及響應面分析結果

2.2.1 平菇發酵刺梨果渣的Box-Behnken試驗設計及響應面分析結果

在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken中心組合設計原理進行試驗設計，根據表2中的編碼與水平進行試驗，設計方案與試驗結果見表3。對試驗結果進行多元擬合回歸，得到回歸方程：Y（平菇發酵SDF得率）=7.24+0.36A+0.25B+0.40C+0.29D-0.19AB-0.20AC-0.12AD-0.19BC-0.26BD-0.100CD-0.75A2-0.50B2-0.44C2-0.58D2。

表3 平菇發酵刺梨果渣響應面試驗設計及結果

表4 平菇發酵刺梨果渣中可溶性膳食纖維得率的回歸模型方差分析

由表3可知，因受到不同因素及其添加量的影響，平菇發酵刺梨果渣SDF得率有所不同。對響應面法優化試驗結果建立模型，方差分析結果見表4，可知該模型p＜0.000 1，說明此模型真實可靠。失擬項的p=0.060 8，模型的失擬度差異不顯著。因此，該模型的擬合程度比較好。相關系數R2=0.982 9，說明模型與實際試驗擬合情況接近。

2.2.2 平菇發酵刺梨果渣響應面結果分析

根據回歸方程，各因素及其交互作用下對平菇發酵刺梨果渣SDF得率影響的響應面圖及等高線圖如圖5所示。三維響應面可以反映每兩個因素之間的交互作用，等高線形狀越趨于橢圓形，表明其交互作用越明顯。從圖5可以看出，氯化鉀與液料比之間的響應面曲線較為陡峭，而且等高線接近橢圓形，兩因素之間交互作用最為明顯，與方差分析結果一致；因此可得，影響平菇發酵刺梨果渣SDF得率的主次因素順序為糖添加量（C）＞氯化鈣添加量（A）＞液料比（D）＞氯化鉀添加量（B）。

2.2.3 平菇發酵刺梨果渣SDF得率最佳提取條件優化與驗證

由響應面分析可得，平菇發酵刺梨果渣SDF提取最佳工藝參數為：氯化鉀添加量0.63%、氯化鈣添加量1.02%、糖添加量4.37%、液料比7.09∶1（mL/g）。在此條件下SDF得率理論值可達7.39%?？紤]到試驗操作的可行性，將提取工藝參數修正為：氯化鉀添加量0.6%、氯化鈣添加量1.0%、糖添加量4.0%、液料比7.0∶1（mL/g）。在此條件下重復3次驗證試驗，SDF得率為7.29%±0.05%，與理論值大致一致。證明該模型是可行真實的，具有實用價值。

圖5 各因素交互作用對平菇發酵刺梨果渣SDF得率影響的響應面圖

2.2.4 游離氨基酸的含量與分析

人體所需氨基酸主要包括必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA），而必需氨基酸必須從體外攝取，所以必需氨基酸的含量和構成比例是評價蛋白質營養價值的重要標準，發酵前后刺梨果渣中氨基酸的含量見表5。由表5可知，發酵過程增加刺梨果渣中游離氨基酸的含量，游離氨基酸含量由0.234 6 mg/mL增加至1.083 9 mg/mL。氨基酸作為機體營養的第一要素，不僅直接或間接參與各種生命活動，還在食物、食品品質方面起到重要作用。食物蛋白營養價值的優劣主要取決于所含必須氨基酸的種類、數量和組成比例，其組成比例越接近人體需要氨基酸的比例，則其質量就越優[26]。經平菇發酵后的刺梨果渣中必需氨基酸的含量比新鮮果渣高11倍，這表明，發酵過程顯著提高必需氨基酸含量，使刺梨果渣更具營養價值。

自然界中氨基酸有20余種，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、賴氨酸9種氨基酸一般在植物中含量少，而且有些在人體內不能合成，但又是維持機體平衡所必需的重要物質，稱為藥用氨基酸[27]。谷氨酸作為神經中樞及大腦皮質的補劑，對于治療腦振蕩或神經損傷、癲癇以及對弱智兒童均有一定療效，又能預防和治療肝昏迷，保護肝臟，是肝臟疾病患者的輔助藥物[28]。精氨酸是鳥氨酸循環中的一個組成成分，具有極其重要的生理功能，有助于將血液中的氨轉變為尿素而排泄出去，故對高氨血癥、肝臟機能障礙等均有功效，具有提高機體免疫力的作用[29]。天冬氨酸對增強肝功，緩解疲勞，預防心臟病、高血壓等疾病起到重要作用[30]。發酵后刺梨果渣中藥用氨基酸占TAA含量的68%左右。因此富含各種藥用氨基酸的發酵刺梨果渣可作為藥用價值較高的植物蛋白資源。

表5 發酵前后刺梨果渣中氨基酸的含量

3 結論與討論

刺梨果渣中雖富含豐富的營養物質，但存在適口性差、消化率低等缺點，而微生物發酵法可減少果渣中纖維素、木質素、植酸、果膠、單寧等抗營養成分，同時提高其粗蛋白、氨基酸等營養物質含量，改善果渣的營養結構和營養價值，提高其利用率。試驗采用食用菌發酵法提取刺梨果渣中膳食纖維，采用單因素試驗和響應面分析法優化SDF得率，結合實際分析得到平菇發酵刺梨果渣提取SDF最佳工藝條件：氯化鈣添加量1%、氯化鉀添加量0.6%、糖添加量4%、液料比7∶1（mL/g）。在此條件下，平菇發酵SDF得率為7.33%，高于未接種菌種的新鮮刺梨果渣可溶性膳食纖維得率（用酶法提取測得SDF得率約1.83%），為發酵刺梨果渣SDF得率最高值。且經發酵工藝優化后的刺梨果渣中總游離氨基、必需氨基酸及藥用氨基酸含量顯著提高，增加刺梨果渣的營養價值。果渣作為一種來源豐富而又經濟的資源，綜合開發利用刺梨果渣，既能提高果渣利用價值，延長果渣加工產業鏈，又能減少對環境的污染。運用食用菌發酵制備膳食纖維不僅工藝簡便，提取條件溫和，所得膳食纖維質量較好，而且具有可食用性，發酵后果渣營養成分更高。這不僅豐富刺梨果渣的加工產品，提高其利用率，還對刺梨果渣的開發和綜合利用提供理論參考。