基于二氧化硫含量及聚類分析的芡實比較

蘇州農業職業技術學院（蘇州 215008）

芡實，為睡蓮科植物芡（Semen euryales）的干燥成熟果仁，主要分布于亞熱帶和溫帶地區，是藥食同源材料。作為藥食同源中藥材，采用硫磺熏蒸這樣一種常用的中藥材粗加工方法，雖然可以使藥材迅速干燥，便于儲存，具有漂白、防蟲，防止發霉、生菌，但若過量熏蒸則會對人體產生危害[1-4]。硫熏后的藥材會對藥材中有些活性成分含量降低，需要嚴格控制二氧化硫殘留量[5-7]。因此，二氧化硫殘留是芡實食品安全中的重要問題。

二氧化硫的測定主要有酸蒸餾碘滴定法[8]、酸堿滴定法[9]、氣相色譜法[10-12]、離子色譜法[13-18]、電化學分析法[19-22]等，碘滴定法和酸堿滴定法是中藥材中常用的測定方法，碘滴定法在2015版藥典后改為酸堿滴定法[23]。芡實中二氧化硫殘留測定研究較少，通過酸蒸餾-酸堿滴定方法測定芡實中二氧化硫的殘留量[24]，有助于為嚴格控制芡實的安全性和有效性提供依據。

聚類分析是依據觀察對象某些特征加以歸類的數理統計方法[25]，被廣泛應用于食品藥品成分分析。

1 試驗材料

1.1 儀器

STEHDB-106-1智能一體化蒸餾儀（濟南盛泰電子科技有限公司）；500 mL兩頸圓底燒瓶；10 mL堿式滴定管；碘量瓶；BT124S-CW型電子天平（德國賽多利斯）。

1.2 試藥

氫氧化鈉、鹽酸、30%過氧化氫、乙醇、甲基紅試劑（分析純，上海國藥化學試劑有限公司）；高純氮氣（純度大于99.99%）；已知SO2濃度質控樣（批號18-05，0.59 g/kg）。

1.3 樣品

芡實購買于各地超市、農貿市場，見表1。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 試劑配制

2.1.1.1 甲基紅乙醇試劑（2.5 mg/mL）

精密稱取25.0 mg甲基紅試劑置于10 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。

表1 芡實來源

2.1.1.2 3%過氧化氫溶液

精密量取10 mL 30%過氧化氫溶液置于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.1.1.3 6 mol/L鹽酸溶液

取54 mL鹽酸置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 滴定液的配制及標定

2.1.2.1 氫氧化鈉滴定液的配制

取適量氫氧化鈉，置聚乙烯塑料瓶中，加水振搖溶解使其飽和溶液，冷卻后，離心，上清液備用。

2.1.2.2 氫氧化鈉滴定液的標定

精密稱取6 g在105 ℃干燥至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，加50 mL新沸過的蒸餾冷水，振搖，使其盡量溶解，加2滴酚酞指示液，用2.1.2.1的上清液進行滴定，接近終點時，應使鄰苯二甲酸氫鉀完全溶解，滴定至溶液顯粉紅色，每1 mL氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）相當于20.42 g鄰苯二甲酸氫鉀，根據溶液消耗的量與鄰苯二甲酸氫鉀取樣量，推算出溶液濃度。

實際標定的氫氧化鈉濃度C（NaOH）=0.098 28 mol/L。

2.2 測定原理

在密閉的蒸餾瓶中加入6 mol/L鹽酸將其酸化，樣品中二亞硫酸鹽轉化為二氧化硫，通過氮氣代入到含有雙氧水的吸收瓶中，雙氧水將其氧化為硫酸根離子，利用酚酞作為指示劑，在酸性條件下為粉紅色，因此利用氫氧化鈉進行滴定，溶液變為黃色，來判斷滴定的終點，利用氫氧化鈉的體積消耗量從而計算芡實中的二氧化硫含量。芡實中二氧化硫含量[23]按式（1）計算。

式中：V為供試品溶液消耗氫氧化鈉滴定液體積，mL；V0為空白溶液消耗氫氧化鈉滴定液體積，mL；C為氫氧化鈉滴定液濃度，mol/L；32.03為1 mL氫氧化鈉滴定液（1.0 mol/L）相當于二氧化硫質量，g；m為樣品稱樣量，g。

2.3 空白溶液的制備

取250 mL蒸餾水溶液置于500 mL兩頸圓底燒瓶中，加10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，置于STEHDB-106-1智能一體化蒸餾儀中，通入氮氣同時將氮氣流量調節至0.2 L/min（保證二氧化硫均勻流出），打開冷凝裝置，冷凝管的出口處連接一橡膠導氣管置于250 mL錐形瓶中，錐形瓶內加入50 mL 3%過氧化氫溶液作為吸收液，在吸收液中加入3滴甲基紅乙醇溶液指示劑，并用0.01 mol/L氫氧化鈉滴定液至黃色，打開加熱裝置，使兩頸瓶內溶液至沸，保持微沸1.5 h后，停止加熱，吸收液冷卻后，用氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）滴定至溶液顯黃色，且黃色持續時間20 s不褪色，根據鹽酸的變化來判斷滴定終點，記錄氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）消耗的體積，作為空白溶液消耗量。

2.4 供試品溶液的制備

取湖南岳陽產的芡實，粉碎，過二號篩，精密稱取10.0 g置于500 mL兩頸圓底燒瓶中，加250 mL水和10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，置于STEHDB-106-1智能一體化蒸餾儀中，通入氮氣同時將氮氣流量調節至0.2 L/min（保證二氧化硫均勻流出），打開冷凝裝置，冷凝管的出口處連接一橡膠導氣管置于250 mL錐形瓶中，錐形瓶內加入50 mL 3%過氧化氫溶液作為吸收液，在吸收液中加入3滴甲基紅乙醇溶液指示劑，并用0.01 mol/L氫氧化鈉滴定液至黃色，打開加熱裝置，使兩頸瓶內溶液至沸，保持微沸1.5 h后，停止加熱，吸收液冷卻后，用氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）滴定至溶液顯黃色，且黃色持續時間20 s不褪色，根據鹽酸的變化來判斷滴定終點，記錄氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）消耗體積，利用式（1）計算出芡實中二氧化硫含量。

2.5 重復性試驗

取湖南岳陽產的芡實，粉碎，過二號篩，按照2.4的方法平行制備6份供試品，按照2.2的滴定原理進行滴定，記錄3%過氧化氫吸收液所消耗的氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）的體積來計算，測定結果。

測定結果見表2。結果相對標準偏差在2%之內，表明方法重復性良好。

表2 重復性試驗結果

2.6 穩定性考察試驗

取湖南岳陽產的芡實，粉碎，過二號篩，按照2.4的方法平行制備7份供試品，按照2.4的方法操作進行測定，分別在0，2，4，8，16，20和24 h記錄吸收液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）體積，同時做空白試驗。

結果見表3，δRSD為1.94%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

表3 芡實穩定性試驗結果

2.7 加樣回收率試驗

取湖南岳陽產的芡實，粉碎，過二號篩，稱密稱取6份芡實，按照2.4的方法制備供試品，每份5.0 g，另精密稱取20 mg已知SO2濃度的質控樣品（1 g含二氧化硫0.59 mg），6份，分別加入上述樣品中，進行滴定測定，記錄吸收液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L）的體積，同時做空白試驗，計算加樣回收率。

加樣回收率試驗的平均回收率為86.21%，δRSD為3.89%，相對標準偏差在5%之內，符合中國藥典四部藥品分析方法學中回收率的要求。結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果

2.8 樣品含量測定

取28批不同產地的芡實，粉碎后，精密稱取10 g，每批平行制備2份，按照2.4的樣品溶液的方法制備，進行測定。

樣品含量測定結果見表5，結果表明不同產地芡實樣品中二氧化硫含量相差很大。

表5 28批芡實樣品中二氧化硫測定的結果

2.9 聚類分析

對28個不同產地的芡實中的二氧化硫含量進系統聚類分析，采用SPSS 20統計軟件，組間聯接方法，平均Euclidean距離，進行層次聚類，平均Euclidean距離為5時，28批次芡實藥材樣品共分為三大類，見圖1。其中，2號（福建寧德）、11號（江蘇高郵）、8號（江蘇蘇州）、7號（江西上饒）、12號（江蘇揚州）、24號（云南麗江）、10號（江蘇興化）、19號（廣西桂林）、9號（江蘇徐州）、18號（貴州銅仁）、1號（湖南岳陽）、3號（福建莆田）為第一類；15號（湖南益陽）、17號（四川中江）、13號（安徽安慶）、27號（山東棗莊），28號（山東臨沂）、14號（安徽蕪湖）、16號（四川成都）、25號（廣東揭陽）、6號（廣東潮州）、22號（遼寧沈陽）、23號（遼寧鐵嶺）、26號（廣東江門）、4號（廣東湛江）為第二類；20號（河北安國）、21號（遼寧遼陽）、5號（廣東肇慶）為第三類。由系統聚類分析可以看出同類之間的二氧化硫含量結果相似度較高，比如第三類中20號（河北安國）、21號（遼寧遼陽）、5號（廣東肇慶）這3個產地中的二氧化硫含量均高于150 mg/kg，二氧化硫超標，因此在食用時應引起注意，同時食品藥品監督管理部門應關注，從而保證芡實食用安全性。

圖1 28批次芡實藥材中二氧化硫含量的聚類分析

3 結論

通過測定28個不同產地批次的芡實中二氧化硫含量，發現結果相差很大，可能與當地生長環境氣候有關。中國藥典對山藥、天麻、天花粉、白芍、粉葛、牛膝等藥材中二氧化硫的限量標準主要是300 mg/kg，除另有規定外中藥材及飲片中二氧化硫不得過150 mg/kg，不同國家的限量值也不同，韓國為二氧化硫不得過30 mg/kg，日本為二氧化硫不得過50 mg/kg，美國為二氧化硫不得過50 mg/kg，WHO為二氧化硫不得過150 mg/kg，食品中對于蔬菜干中（包括種子、堅果等）的限量值為500 mg/kg，由于芡實屬于藥食同源的藥材。

結果表明，如果以中藥材的標準判斷，測定的28個不同產地批次的芡實3個產地批次的樣品不合格，不合格率為10.7%；如果以食品干果限量判斷，則全部合格；如果出口到韓國，則不合格率為60.7%；出口到日本和美國，則不合格率為53.6%，因此二氧化硫對于芡實藥材的安全性和出口具有一定限制。

不同產地芡實都檢出含有二氧化硫，硫磺熏蒸是一種傳統的中藥材加工方法，應用比較廣泛，解決硫熏的難題，需要從種植源頭抓起，在原料生產、流通、銷售過程中隨時監管、隨時監控，而且要通過大量試驗數據，制定合理限度范圍，提高原料安全性和有效性。