發酵產赤蘚糖醇研究進展

王建彬，郭傳莊，王松江，隋松森，李俊霖

諸城東曉生物科技有限公司（諸城 262200）

赤蘚糖醇（Erythritol），又名原藻醇，它屬于多元醇類甜味劑，在自然界中廣泛存在，在動物、植物、微生物中均有發現，如在真菌類微生物、水果、各類發酵食品、動物組織及體液等中均發現有少量赤蘚糖醇存在。1999年赤蘚糖醇被國際食品添加劑委員會批準作為食品甜味劑，是一種純天然的綠色保健食品[1]。2003年歐盟食品科技委員會（SCF）認為，赤蘚糖醇用于食品是安全的，并于2016年批準赤蘚糖醇作為風味增強劑用于低能或無添加糖調味飲料。同年，加拿大衛生部發布通報，批準赤蘚糖醇作為甜味劑用于部分碳酸飲料。根據歐盟REG.（EU）673/2016，赤蘚糖醇可作為食品添加劑用于有機食品中[2]。近年來，隨著對赤蘚糖醇研究逐步深入，其作為一種純天然的、健康的添加劑被越來越多的消費者所接受，其應用領域也更加廣闊。

1 赤蘚糖醇的性質

赤蘚糖醇是由葡萄糖經發酵而得到的一種白色晶體，其甜度是蔗糖甜度的70%～80%，甜味純正，無后苦味[3]。它在溶解過程中吸收熱量，有類似于麥芽糖醇的清涼感，適宜作甜味劑。赤蘚糖醇結晶性好，幾乎不吸潮，甚至在20 ℃、相對濕度90%情況下仍不吸潮[4]。赤蘚糖醇耐熱性強，在普通的烘焙過程中，不會受熱分解和發生褐變。赤蘚糖醇耐酸性較強，酸性條件下不會分解[5]。相較于其他糖類，赤蘚糖醇不能被細菌發酵利用，而且可以抑制部分微生物生長，因此，赤蘚糖醇具有食品防腐劑和甜味劑的雙重功效。另外，人體消化系統中沒有分解赤蘚糖醇的酶，超過90%的赤蘚糖醇直接通過尿液排出體外，并不經過人體代謝且不會改變血糖濃度和胰島素水平，所以，糖尿病患者食用該糖醇不會影響健康。經試驗表明，赤蘚糖醇對多種口腔鏈球菌具有抑制作用，其抑制效果優于木糖醇。此外，因赤蘚糖醇具有保濕和改善皮膚粗糙的效果，如日本資生堂研制配有赤蘚糖醇的護膚用品，以取代化妝品中甘油的添加[6-7]。在化工行業，赤蘚糖醇逐漸被廣泛應用于合成多種功能化合物，如表面活性劑、樹脂材料[8]。近年來。隨著相變材料受到越來越多的關注，赤蘚糖醇作為熱能存儲的相變材料，被廣泛應用于廢熱回收利用、太陽灶、吸收式制冷機、汽車冷卻液廢熱回收系統等[9-12]。

2 赤蘚糖醇生產工藝

赤蘚糖醇的生產以淀粉為原料有2條工藝途徑，即化學法和發酵法?；瘜W法是將淀粉用高碘酸法生成雙醛淀粉，經氫化裂解生成赤蘚糖醇和其他衍生物。因為化學法的工藝流程長，生產成本高，對環境影響大，化學法逐漸被發酵法取代。發酵法將淀粉以酶法進行液化、糖化生成葡萄糖，采用耐高滲酵母或細菌進行微生物發酵，使葡萄糖轉化成赤蘚糖醇。其具體生產流程：淀粉→液化→糖化→葡萄糖→生產菌株發酵→過濾→色層分離→凈化→濃縮→結晶→分離→干燥，得到赤蘚糖醇。國內赤蘚糖醇生產企業多以發酵法為主。

赤蘚糖醇的生產菌株多為酵母，少部分為霉菌和細菌。從菌種的生產能力及產物情況來看，耐高滲酵母是最為適宜的赤蘚糖醇生產菌株。能生產赤蘚糖醇的菌種有假絲酵母屬（Candida）、球擬酵母屬（Torulopsis）、從梗孢酵母屬（Moniliella）、三角酵母屬（Trigonopsis）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、漢森氏酵母屬（Hansenula）等屬。

中國對于赤蘚糖醇發酵的研究雖起步較晚，但近年來取得成效。范光先等[13]發現球狀酵母OS-194可用于赤蘚糖醇的發酵；吳燕等[14]通過20%初始葡萄糖通加補料發酵法，使赤蘚糖醇含量達到162.5 g/L；裴疆森等[15]通過定向誘變篩選出一株解酯假絲酵母使用35%濃度葡萄糖發酵，赤蘚糖醇轉化率達52%以上。

3 與赤蘚糖醇相關的研究方向

近年來，隨著赤蘚糖醇在食品、醫藥和化工等領域得到應用，其全球需求量逐年攀升。但是較低的生產總量無法滿足日益增長的需求，赤蘚糖醇市場面臨著巨大供需缺口。所以，對赤蘚糖醇產業的大力發展和深入研究顯得尤為重要。

3.1 菌種的選育和誘變

對于赤蘚糖醇發酵的優化策略主要是以誘變篩選耐高滲酵母為主。自然界中的高糖環境為篩選耐高滲野生菌株提供條件，如蜂蜜和花粉。同時，自然突變及人工誘變也是篩選產赤蘚糖醇優良突變菌株的主要來源。對于高產赤蘚糖醇菌株的獲取主要是人工誘變。通過人工誘變的方式能夠提高菌株突變率。Ishizuka等[16]通過紫外線和亞硝基胍（NTG）處理篩選得到的赤蘚糖醇高產菌Aureobasidiumsp.SN124A，對葡萄糖轉化率達到47.6%。Yang等[17]報道高滲酵母C.magnoliae的突變株生產赤蘚糖醇的濃度比野生菌株提高25%，生產速率提高30%。還有一株Penicilliumsp.KJ81菌株經UV誘變處理后，篩選的菌株不僅其赤蘚糖醇的產量大幅增加，且同時降低副產物甘油的生成以及發酵過程中泡沫的產生[18]。

隨著誘變技術的發展，多種誘變方式的組合進一步提高誘變育種效率。一些新的誘變技術的廣泛應用為高效誘變育種提供可能。如常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術，因其易操作，突變率高，安全無毒的特點被越來越多的企業使用。楊利博[19]報道稱，通過ARTP和硫酸二乙酯（DES）復合誘變，獲得的菌株Y-07，其赤蘚糖醇產量、得率分別比初發菌株提高217.5%，71.4%，且遺傳形狀穩定。

另外，近年來基因工程技術的迅猛發展，為獲得優良的赤蘚糖醇發酵菌株提供新方式。有報道稱，可采用分子生物技術手段阻斷或降低副產物產生途徑，從而使目標產物的產量及純度提高。高慧[20]利用Cre-Loxp系統敲除Torulasp.菌株的3-磷酸甘油脫氫酶基因，并將得到的2株菌株進行雜交融合，經優化發酵工藝，最終赤蘚糖醇產量達到253 g/L，且副產物甘油濃度大幅降低。

3.2 菌種的馴化和培養基優化

工業生產上以追求“低投入，高產出”為工藝路線的設計原則。菌種的遺傳穩定性和經濟化的培養方式，是發酵行業最注重的環節。每一株選育出的菌種，尤其是誘變篩選后的菌種均要經過遺傳穩定性的檢測。劉鳳珠等通過紫外誘變試驗獲得一株耐高滲透壓菌株，其生產赤蘚糖醇濃度提高98%，并通過5代傳代試驗證明為穩定遺傳[21]。

對于產赤蘚糖醇的耐高滲酵母，高濃度的起始葡萄糖有利于赤蘚糖醇的積累。Lee等[22]報道起始葡萄糖質量濃度為400 g/L時，球擬酵母仍然能夠高效生產赤蘚糖醇。但是過高的底物濃度會帶來較高的滲透壓，進而抑制酵母細胞的生長及代謝。因此，在以葡萄糖為底物的赤蘚糖醇發酵過程中，通常以分批及補料分批的發酵方式，維持葡萄糖在較高濃度水平。Ryu等[23]報道通過分階段控制菌體生長和赤蘚糖醇生成可有效提高赤蘚糖醇產量。另外，由于赤蘚糖醇是還原性代謝產物，相關的氧化還原酶涉及到多種金屬離子的輔助因子。所以，對于耐高滲酵母其他營養物質和微量元素進行調節同樣能夠起到提高赤蘚糖醇產量的效果。如發酵過程中以植酸代替磷源能提高發酵速率[24]。在發酵培養基中添加對產赤蘚糖醇關鍵酶起調節作用的金屬離子，如Cu2+可促進赤蘚糖醇還原酶的活性，進而提高赤蘚糖醇產量[25]。

3.3 產赤蘚糖醇代謝路徑研究

提高微生物產赤蘚糖醇的能力，必須要了解其代謝路徑。通常情況下，真菌通過磷酸戊糖途徑（PPP）合成赤蘚糖醇，轉酮酶是磷酸戊糖途徑中的關鍵酶，需要高活性的轉酮酶來生成大量的中間產物，進而合成赤蘚糖醇。以酵母菌為例，酵母菌攝入的葡萄糖首先轉化為6-磷酸葡萄糖，經過磷酸戊糖途徑生成4-磷酸赤蘚糖，在 4-磷酸赤蘚糖激酶的作用下去磷酸化，生成赤蘚糖，赤蘚糖在赤蘚糖還原酶的作用下生成赤蘚糖醇。有報道稱優良的酵母基因突變株，以葡萄糖為底物，經發酵后赤蘚糖醇得率達40%[26]。

細菌中能夠合成赤蘚糖醇的主要為乳酸菌。其代謝途徑與酵母菌有所區別。細菌中葡萄糖經過糖酵解生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖在磷酸葡萄糖異構酶的作用下異構化生成6-磷酸果糖，在磷酸轉酮酶作用下6-磷酸果糖裂解成乙酰磷酸和4-磷酸赤蘚糖，4-磷酸赤蘚糖在4-磷酸赤蘚糖脫氫酶作用下生成4-磷酸赤蘚糖醇，4-磷酸赤蘚糖醇在去磷酸酶作用下生成赤蘚糖醇。由于赤蘚糖醇發酵過程中底物濃度較高，而細菌的環境脅迫耐受能力又弱。所以，赤蘚糖醇發酵生產多以耐高滲酵母為主要發酵菌株。

圖1 微生物產赤蘚糖醇代謝路徑

3.4 關鍵酶-赤蘚糖醇還原酶的研究

根據微生物的赤蘚糖醇代謝途徑，能夠分析出其生產過程中的關鍵酶，進而通過研究該酶的特性進一步提高赤蘚糖醇產量。如研究關鍵酶的最佳反應參數、分子構型等，通過對關鍵酶進行克隆和表達，使關鍵酶得到積累；通過分析確定該酶反饋調節作用位點，并進行定點突變，調高酶活，進而提高目標產物的積累。赤蘚糖還原酶是耐高滲酵母菌產赤蘚糖醇的關鍵酶。對赤蘚糖還原酶進行較多研究，為通過酶蛋白工程和基因工程技術改良赤蘚糖醇的生產奠定基礎。Lee等[22]對一種來源于Torula corallina的NADPH依賴型赤蘚糖還原酶進行研究，發現其最佳反應pH 6.0，最佳反應溫度40 ℃，并發現該酶不產生其他產物，專一性高，為該菌種產赤蘚糖醇較多提出解釋。Park等[27]發現Candida magnoliae中的赤蘚糖還原酶的表達受來自于高濃度的糖，KCl和NaCl所造成的高滲透壓影響，較高的滲透壓能夠促進該酶的表達。Lee等[28]對一株新分離菌株Candida magnoliaeJH110的赤蘚糖醇還原酶進行克隆，獲得該酶的基因序列，并以大腸桿菌為宿主菌進行克隆表達，經試驗發現該酶最適pH 5.5，最適溫度42 ℃，并證明該酶可使其他非產赤蘚糖醇的微生物具備生產赤蘚糖醇的能力。

4 展望

赤蘚糖醇作為一種理想的多功能的健康甜味劑，適宜于糖尿病患者，能抑制口腔細菌生長，其應用領域越來越廣泛。微生物發酵法替代化學法，其優越性也愈加明顯。對于提高微生物產赤蘚糖醇產率，主要是篩選耐高滲酵母和誘變育種新菌株，這2種方法雖然簡單易行，但也具有盲目性。現在的生物技術，尤其是微生物酶技術和基因工程技術的快速發展，為高效生產赤蘚糖醇開辟了新道路。如研究微生物產赤蘚糖醇關鍵酶的提取與使用條件，使其在菌外進行赤蘚糖醇的直接轉化；通過定點突變與基因敲除對關鍵酶進行改造等一系列方式提升酶活進而提高赤蘚糖醇的產量；對影響代謝的關鍵因子進行敲除或調控，改變代謝途徑，將代謝通路引流到合成赤蘚糖醇的方向，進而減少副產物的生成，提高赤蘚糖醇產量。