環糊精葡萄糖基轉移酶的固定化研究進展

郭姣梅，郝建華，李曉涵，王偉，孫晶晶，宋凱

1.農業農村部極地漁業開發重點實驗室，青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所（青島 266071）；2.上海海洋大學食品學院（上海 201306）

環糊精葡萄糖基轉移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）屬于α-淀粉酶第13號家族的重要成員，可催化淀粉轉化為環糊精。環糊精（CD）是由6個（α-CD），7個（β-CD）或8個（γ-CD）D-吡喃葡萄糖單體以α-1,4-糖苷鍵連接而成的環狀低聚糖。它是一種筒形結構的分子，具有內部疏水、外部親水的結構[1-2]，正是基于這種特殊結構，使得環糊精及其衍生物在食品、醫藥、生物技術、化妝品、化學工業、膳食纖維及其他方面有很大應用前景[3-8]。生產環糊精需要大量具有高特異活性的CGTase。因此，有關CGTase的研究越來越多[9]，但由于游離CGTase在工業應用中不可重復使用，穩定性差等不利因素，使得其應用受到很大限制，故需要將酶進行固定化解決這個問題。將CGTase固定化后，提高其穩定性，使其能夠反復使用，同時便于運輸和儲存，有利于自動化生產。國內在固定化酶方面的研究較為常見，但對CGTase的固定化研究報道較少，因此對CGTase的固定化研究進展進行闡述。

1 CGTase固定化方法的國內外研究現狀

固定化酶是20世紀60年代發展起來的一項新技術。1971年首屆酶工程會議上確認“固定化酶”的術語。固定化酶即酶的定位和限制，是指將游離酶與載體結合，使游離酶被固定在一個有限空間內，不能自由移動，但仍處于溶解狀態[10]。酶被固定化后，易于從產物和底物中分離，能夠有效回收和再利用。相比于游離酶，固定化酶的熱穩定性和操作穩定性均增強[11]。

酶的傳統固定化技術如圖1所示，主要分為吸附法、包埋法、載體交聯法、共價結合法等。1977年，Nakamura等[12]首次報道CGTase的固定化研究，此后固定化CGTase的研究越來越多。

圖1 酶的固定化技術分類[13]

1.1 吸附法

吸附法作為最簡便的方法，它主要是依靠酶蛋白和各載體之間的弱作用力，如氫鍵、范德華力、疏水作用力等，使酶被吸附在載體材料表面或固定在介孔材料的孔隙中[13]。吸附法分為物理吸附法和離子吸附法，其中物理吸附法是常用的一種方法。在這種固定化方法中，常用的載體是陽離子和陰離子交換樹脂、活性炭、硅膠、氧化鋁、陶瓷等。

對CGTase的固定化而言，吸附法是早期研究較多的一種固定化方法，Suhaimi等[14]采用吸附法將CGTase固定在聚偏二氟乙烯（PVDF）中空纖維膜上。研究固定化CGTase的穩定性和可重復使用性。結果表明，固定化CGTase顯示出良好的物理和化學特性，在70 ℃下仍能保持50%初始活性且其穩定性也得到改善，有利于在工業中應用。

1.2 共價結合法

共價結合法是以載體材料上的基團和酶蛋白中的相應基團（如羧基、氨基、醛基等）形成共價鍵，使酶被固定在載體上，因此載體材料是影響共價鍵固定化酶性能的關鍵因素，共價結合法是研究最多，也是最成熟的一種固定化方法。

共價結合法中固定化酶載體的選擇越來越廣泛。Sulaiman等[15]用漂白的洋麻超細纖維來固定化CGTase，將CGTase通過間隔臂-配體之間的相互作用成功地固定在纖維素納米纖維（CNF）上。研究固定化CGTase的儲存穩定性、熱穩定性和可重復使用性。結果表明，固定化CGTase在CNF上的蛋白結合產率超過62%，并獲得超過45%的殘留活性。固定化CGTase在重復使用10次時最多可保留50%～60%的CGTase活性。研究表明通過共價結合可將CGTase成功固定在CNF上。Schoffer等[16]用2種不同方法固定化CGTase，分別是使用戊二醛活化的氨基化二氧化硅載體（Si-NH-G-CGTase）和巰基化二氧化硅載體（Si-SH-CGTase）。固定化后，Si-NH-G-CGTase具有較高的總生產率，能保持100%初始活性至少200 h，而Si-SH-CGTase只能保持初始活性的40%。

探究采用化學共沉淀法制備Fe3O4納米粒子，并依次以正硅酸四乙酯（TEOS）為硅源、以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）為硅烷偶聯劑對磁性納米粒子進行表面修飾，最終得到氨基硅烷化的磁性納米粒子（Fe3O4@SiO2-NH2）。利用該磁性材料固定化CGTase的固定化酶熱穩定性、對酸堿的耐受性和儲存穩定性明顯優于游離酶。

1.3 包埋法

包埋法是指利用凝膠網格和高分子半透膜材料，使酶分子被包埋于特定的結構之中[17]。包埋法分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法[18]。20世紀80年代，有研究首次將CGTase包埋在藻酸纖維中。

常用的包埋物質是海藻酸鹽。郭燕等[19]研究CGTase被海藻酸鈉包埋固定的最優條件。研究表明，固定化酶的pH穩定性及熱穩定性要優于游離酶。連續使用7次后仍有75%的酶活，有良好的操作穩定性。Rakmai等[20]將CGTase與含有3 g/100 mL海藻酸鈉和3 g/100 mL明膠的糊狀物混合，可獲得固定化產率87.5%的包埋酶。在50 ℃溫育12 h后，固定化CGTase保留超過50%初始活性，而游離CGTase僅保留30%左右。

1.4 交聯法

交聯法是利用雙功能或多功能團的交聯劑，與酶分子中的氨基（—NH2）、羧基（—COOH）發生化學連接，使酶分子之間形成一種相互關聯的復雜結構，其不溶于水，易于從溶液中分離，因此得到固定化酶[21]。交聯法中使用較多的交聯劑是具有雙功能團醛基的戊二醛。

1.4.1 載體交聯法

楊紅藝等[22]以DEAE纖維素、硅膠、殼聚糖為載體，戊二醛為交聯劑，對α-CGTase進行固定化最佳條件和固定化酶性質研究。結果表明，固定化酶可以連續使用4次以上，且在4 ℃ CaCl2溶液中保存18 d，有80%以上活力。校秋燕等[23]以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯劑共價交聯固定CGTase。研究表明，在最佳固定化條件下，固定化CGTase的酶活回收率達94.5%，比活最高為39.7 U/g。這使固定化CGTase催化甜菊糖的轉葡萄糖基反應成為可能。

1.4.2 無載體交聯法

載體對CGTase進行固定化過程復雜，成本較高。交聯酶聚集體（CLES）是一種無載體固定化技術，通過加入戊二醛等雙功能交聯劑，將聚集在一起的酶分子相互交聯，從而得到固定化酶。Zhang等[24]將CGTase通過戊二醛交聯，獲得重組的交聯酶聚集體CGTase（CLEA-CGTase）。在85 ℃下，CGTase活力75 U/mL時，將CGTase與體積分數0.1%戊二醛交聯10 min，可以得到固定化效果最佳的CLEA-CGTase。

1.5 其他固定化方法

任意一種酶的固定化方法可能有很多種，但不是每一種方法都適用于任意一種酶，故具有一定的局限性。為獲得固定化性能良好的酶，通常將固定化技術中的多種方法結合起來用于酶的固定化。Manab等[25]通過物理吸附法和包埋法在多孔中空纖維膜中將重組大腸桿菌表達的CGTase固定。Matte等[26]以SiO2表面引入氨基為載體，并加入交聯劑戊二醛來固定CGTase，得到的固定化酶的酶活回收率達83%，重復使用15次后，酶活仍保持在60%左右。Ibrahim等[27]通過物理吸附和共價連接將CGTase共價固定在氨基化二氧化硅涂覆的用陰離子或陽離子表面活性劑制備的磁性納米顆粒上。結果表明，用陰離子表面活性劑制備的活性mag@d-SiO2@m-SiO2-NH2共價連接酶固定化效率最高（98.1%），負載效率為96.2%，這是目前報道的最高固定化產率和負載效率之一。此外，固定化CGTase熱穩定性和耐酸堿性顯著增強，且表現出良好操作穩定性，在10次連續反應后保留初始活性的56%。

黃立萍[28]采用吸附-交聯-包埋法對CGTase進行固定化，用介孔分子篩SBA-15吸附，戊二醛交聯，海藻酸鈉包埋，得到的固定化酶熱穩定性和pH穩定性均優于游離酶，重復使用4次后，固定化酶的殘余酶活力仍保留50%以上，但由于包埋法制得的凝膠在重復使用過程中易發生泄露，故固定化酶使用4次以后，機械強度下降，該方法得到的固定化酶的重復使用性有待提高。

2 固定化酶的各種方法比較（見表1）

表1 固定化方法的優缺點

3 固定化CGTase的應用

CGTase可以通過環化反應液化淀粉的分子內轉糖基來生產環糊精（CD）。Gimenez等[34]通過表面錨定（SCGT-A）和共價結合法（SCGT-CB）將商業CGTase固定在二氧化硅上，并將固定化酶用于CD生產。結果表明，使用SCGT-A比SCGT-CB和游離酶效率更高，在24 h內，SCGT-A產生的CD總數量比SCGT-CB多70.49%，比游離酶多18.15%。通過SCGT-A和SCGT-CB方法獲得CD的產量證明，固定化CGTase在工業上的應用是可行的。Schoffer等[35]研究反應條件對固定化β-CGTase生產α-CD、β-CD和γ-CD的影響。結果表明，pH、溫度和反應時間對α-CD、β-CD和γ-CD的定向生產具有重要意義。研究提出使用相同的固定化CGTase生產CD可能性，特別是對具有重要工業意義的γ-CD的生產。

CGTase可廣泛應用于VC衍生物2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸（AA-2G）的生產。AA-2G因穩定性好、安全性高、易被人體吸收等特點，而被認為是最佳VC替代品。AA-2G在人體內可以分解為VC和葡萄糖，因此被廣泛應用于食品、化妝品、醫療保健等行業。

由于固定化CGTase比游離CGTase穩定性好、經濟效益高，所以固定化CGTase生產AA-2G得到的產量要優于游離酶。單麗媛[36]分別采用包埋法、吸附法、載體結合法來固定化CGTase，3種方法的固定化載體分別是海藻酸鈉、聚乙二烯苯小球、殼聚糖，用這3種載體固定化CGTase后，對其轉化合成AA-2G的條件進行研究，其中海藻酸鈉固定化CGTase轉化合成AA-2G產量可達17.18 g/L。

4 結語和展望

由于CGTase在各方面的廣泛應用，特別是用于生產CD和AA-2G，使CGTase的需求巨大，因此出現大量關于CGTase的研究，為工業應用奠定基礎。對于CGTase固定化方法研究越來越多，但仍存在許多問題，如固定化效率不高、工業應用比較少等，因此采用最佳固定化技術和載體等以提高CGTase的固定化效率及進一步將固定化CGTase應用于工業是未來重點研究方向。