高效液相色譜串聯質譜法測定紅心鴨蛋中紫杉紫素含量

蔡翔宇，歐玉玲，陳曉蘭，梁宇

1.南寧海關技術中心（南寧 530021）；2.桂林海關（桂林 541000）

天然紅心鴨蛋的蛋黃呈朱砂紅色，色澤穩定、自然，在市場上深受消費者喜愛。普通蛋黃的黃色色素主要由葉黃素、玉米黃質、新黃質、紫黃質等黃色類胡蘿卜素組成[1-2]，其來源為飼料中谷物類糧食或綠色植物中的黃色類胡蘿卜素。根據有關研究[3-5]，蛋鴨通過放養或給飼新鮮菹草可以生產出天然紅心鴨蛋，天然紅心鴨蛋中含有一種名為紫杉紫素（Rhodoxanthin）的紅色類胡蘿卜素，其分子式為C40H50O2，結構式見圖1。類胡蘿卜素對人體具有重要的生理作用[6]，研究顯示[7-11]，紫杉紫素對人體具有抗氧化、清除自由基、增強免疫、抑制腫瘤的發生等作用。

圖1 紫杉紫素化學結構式

隨著生活水平提高，天然綠色食品的保健功能越來越受到人們的重視。因此，對天然紅心鴨蛋中紫杉紫素的研究具有重要意義。有關天然紅心鴨蛋中的紫杉紫素的檢測定量方法并未見有報道。試驗通過利用高效液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS），建立紅心鴨蛋中紫杉紫素的準確定量方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP 5500三重四極桿質譜（美國AB SCIEX公司）；Nexera高效液相色譜（日本島津公司）；KQ-400DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SIGMA3-18K高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）；R-300旋轉蒸發儀（瑞士步琦公司）；Milli-Q Integral 10超純水機（美國Millipore公司）。

紅心鴨蛋樣品去殼后，用高速組織搗碎機充分搗碎、混勻。

紫杉紫素（99.8%，瑞士Carote Nature公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；二氯甲烷（色譜純，美國TEDIA公司）；正己烷（色譜純，美國TEDIA公司）；正丙醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；試驗用水（由Milli-Q Integral 10超純水機制備）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

精密稱取10 mg紫杉紫素標準品分別置于100 mL容量瓶中，用少量二氯甲烷溶解，用乙腈定容至刻度，配制成質量濃度100 μg/mL標準儲備液，于-20 ℃保存。用時根據具體情況用乙腈稀釋成適當濃度的系列標準工作溶液。

1.2.2 色譜條件

采用Shim-pack XR-ODS Ⅲ（1.6 μm，2.0 mm× 75 mm）色譜柱；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流動相A為5 mmol/L乙酸銨，流動相B為乙腈；流速0.3 mL/min梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描，多反應檢測模式（MRM），氣簾氣（CUR）35.0 psi；碰撞氣壓Medium，霧化器（GS1）55.0 psi，輔助加熱器（GS2）50.0 psi，離子源電壓（IS）5 500 V，輔助加熱器溫度（TEM）600 ℃；其他條件見表2。

表2 質譜參數

1.2.4 樣品前處理

準確稱取5 g（精確至0.01 g）均質樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈及5 g無水硫酸鈉后，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，以4 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至100 mL旋轉蒸發瓶中。對離心管中的殘渣每次用20 mL乙腈再重復提取2次，合并3次收集的乙腈相，加入5 mL正丙醇，于40 ℃旋轉蒸發濃縮至干，用5 mL乙腈溶解并轉移至15 mL離心管中，加入3 mL正己烷，渦旋1 min，以4 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷相，下層乙腈相過0.22 μm濾膜后，上機分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

將200 ng/mL的單標準溶液用流動注射泵連續射入質譜儀，在正模式下做一級質譜全掃描，確定母離子。紫杉紫素相對分子質量為562.84，故將質譜掃描范圍設置為m/z510～610以排除雜質干擾提高靈敏度。圖2為紫杉紫素的一級質譜圖。結果表明，紫杉紫素可以形成[M+H]+峰和[M+Na]+峰，但[M+Na]+峰容易受到系統管路、流動相、樣品基質的干擾而不夠穩定，因此選擇穩定的[M+H]+峰。對母離子施加一定的碰撞能量進行二級質譜掃描，二級質譜圖見圖3。m/z282，m/z265，m/z284和m/z246為主要的離子碎片峰，選擇豐度較高、干擾較少的2個碎片離子作為定量和定性離子，同時優化碰撞能、去簇電壓、碰撞室入口電壓和碰撞池電壓等各項質譜參數。紫杉紫素標準物質多反應監測（MRM）色譜圖見圖4。

圖2 紫杉紫素一級質譜圖

圖3 紫杉紫素二級質譜圖

圖4 紫杉紫素標準物質多反應監測（MRM）色譜圖

2.2 色譜條件的優化

紫杉紫素屬于弱極性化合物，易被反相色譜柱保留，試驗以甲醇-水、乙腈-水體系作為流動相在Shim-pack XR-ODS Ⅲ（1.6 μm，2.0 mm×75 mm）上考察分離效果，結果表明以乙腈-水體作為流動相時候能獲得較高的信號響應值，但由于次級保留效應使得色譜峰存在拖尾現象，因此在水相中添加5 mmol/L乙酸銨作為改良劑，同時提高電離離子化效率。結果表明，色譜峰峰型得到明顯改善，信號響應值也得到提高，因此選擇5 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相。

2.3 提取條件的選擇

類胡蘿卜素可溶于大部分有機溶劑中，不溶于水。參考文獻[12-18]，常用的類胡蘿卜素提取溶劑有二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙腈、丙酮等有機溶劑。分別用上述5種有機溶劑按照1.2.4所述方法進行處理，在相同的色譜條件下進行測定，比較對紫杉紫素的提取效率，結果見圖5。

二氯甲烷、乙腈和丙酮均有理想的提取效率。考慮到二氯甲烷的毒性較大，試驗過程中容易對試驗人員造成傷害，因此不宜大量使用。蛋黃含有大量的脂類物質，如未有效除去，會產生強烈的背景干擾并損傷色譜柱[15]，相比于丙酮，乙腈具有使蛋白變性、減少脂肪進入提取液的特點，有利于后續上機分析，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

圖5 不同溶劑紫杉紫素提取效果的影響

2.4 線性相關性和檢測限

分別配制紫杉紫素質量濃度為5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL標準工作溶液，在選定色譜條件下進行測定，進樣量5 μL，以質量濃度（ng/mL）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）作圖，繪制標準曲線。通過逐漸降低樣品中所添加的標準溶液的濃度，化合物信噪比（S/N）3時，其質量濃度定義為方法檢出限（LOD）。化合物線性方程、相關系數、檢出限結果見表3。

表3 線性方程、相關系數和檢出限

2.5 加標回收率和精密度

選取陰性鴨蛋樣品，添加3個濃度水平的標準混合溶液，按照1.2.4所述方法進行前處理，每個加標水平平行測定6次。由表4可見，3種不同濃度水平的加標回收率在86.7%～94.5%，相對標準偏差在1.62%～3.45%，說明方法的回收率好、精密度高。

表4 方法的回收率和精密度（n=6）

2.6 實際樣品檢測結果

采集當地市場上銷售的10份紅心鴨蛋樣品進行檢測，結果見表5。

表5 樣品中紫杉紫素含量

3 結論

試驗建立紅心鴨蛋中紫杉紫素的高效液相色譜串聯質譜測定方法。樣品用乙腈提取后，經旋轉蒸發濃縮，正己烷脫脂后上機測定。結果表明，該方法操作簡單、靈敏度高且準確性好，為測定紅心鴨蛋中的紫杉紫素提供參考。