HPLC-MS/MS測定蜂花粉中4種有機磷類除草劑

郭愛靜，花中霞，張弘，張世勇，王小青，王可

石家莊市疾病預防控制中心，石家莊市化學毒物檢測及風險預警技術創新中心（石家莊 050011）

蜂花粉是由蜜蜂采集的花粉、花蜜以及蜜蜂的唾液分泌物加工混合而成，被譽為活性天然代謝產物的“寶庫”[1-2]。蜂花粉營養非常豐富，含有氨基酸、碳水化合物、礦物質、酚類化合物和其他生物活性物質[3-4]，既是很好的天然營養食品，又具有抗菌消炎、抗癌和抗過敏等功效[5]，一直備受消費者的青睞[6]。由于花粉暴露于自然環境中，蜂花粉可以作為農藥殘留的生物學標記物[7]。文獻中關于蜂花粉中農殘的檢測以殺蟲劑為主[8-10]，而對除草劑殘留的檢測鮮有報道。

有機磷類除草劑是一類含磷除草劑，常用的有莎稗磷、甲基胺草磷、抑草磷和哌草磷等，被廣泛應用于農業生產中。大部分有機磷農藥屬于高毒性農藥，可引起急性毒性[11]；有機磷類農藥還具有神經毒性，可引起神經系統紊亂，還有致畸、致癌的風險[12-13]。鑒于其危害和大范圍使用，世界各國均制定了食品中有機磷農藥的殘留限量法規[14]，GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》中規定在稻谷、糙米中莎稗磷的最大殘留量均為0.1 mg/kg[15]。

有機磷農藥的主要儀器檢測方法有氣相色譜（GC）法[16]、液相色譜（LC）法[17]、氣相色譜質譜（GC-MS）法[18]、氣相色譜串聯質譜（GC-MS/MS）法[19]、液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法[20]等。液相色譜串聯質譜在分析復雜基質樣品中多組分的痕量分析方面具有高通量、高靈敏度和定性定量準確等優勢。目前，有機磷農藥檢測種類以殺蟲劑和殺菌劑為主，除草劑的檢測相對較少，且分析對象以蔬菜、水果為主[16,18-19]，有關蜂花粉中有機磷類除草劑的檢測研究還未見報道。試驗以分散固相萃取法凈化，建立了蜂花粉中4種有機磷類除草劑的高效液相色譜-串聯質譜分析方法，并對凈化方式、色譜條件和質譜參數進行優化。該方法準確、快速、靈敏度高、選擇性好，適用于蜂花粉中有機磷類除草劑的檢測分析，為開展蜂花粉中除草劑殘留檢測提供了技術手段。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200-6410B高效液相色譜-串聯質譜儀，配ESI電離源（美國Agilent公司）；AE240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MS3渦旋振蕩器（德國IKA公司）；TG16-WS臺式高速離心機（湘鑫儀器儀表公司）；EVAP-12氮吹儀（美國Organomation公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）。

莎稗磷（Anilofos，99.8%，德國Sigma-Alorich公司）；甲基胺草磷（Amiprofos-methyl，10 ng/μL，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；抑草磷（Butamifos）、哌草磷（Piperophos）（純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、丙酮、乙酸乙酯（色譜純，德國Merck公司）；甲醇、二氯甲烷（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純）、N-丙基乙二胺（PSA）（AR，美國Dikma公司）；C18固相萃取柱（上海Welch公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉（AR，天津永大化學試劑公司）；試驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 混合標準系列溶液的配制

分別準確稱取甲基胺草磷、莎稗磷、抑草磷和哌草磷4種標準品，用甲醇溶解配制1.0 mg/mL的標準儲備溶液，保存于-20 ℃冰箱，備用。臨用前用空白基質提取溶液稀釋，配制成1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL混合標準溶液系列。

1.3 樣品前處理

精確稱取2 g蜂花粉樣品，置于50 mL離心管中，加入5 mL水后混勻，靜置10 min。再加入1 g氯化鈉和12 mL乙酸乙酯，渦旋30 s，超聲10 min，以4 000 r/min離心5 min，取出10 mL有機相轉移到放有1.0 g PSA的離心管中，渦旋30 s，離心5 min，取6 mL上清液，在40 ℃下氮吹至盡干，用1.0 mL甲醇/乙腈-水溶液（75∶25，V/V）復溶后，渦旋30 s，經0.2 μm濾膜過濾，按儀器工作條件進行HPLC-MS/MS測定。

1.4 色譜條件

色譜柱，Agilent ZORBAX XDB-C18色譜柱（4.6 mm× 50 mm，1.8 μm）；流速，0.3 mL/min；柱溫，30 ℃；進樣量，3 μL；流動相A，0.1%甲酸水溶液；流動相B，甲醇/乙腈（50∶50，V/V）；流動相比例，75∶25（B∶A）。

1.5 質譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正離子掃描；監測方式，多反應監測（MRM）；干燥氣溫度，350 ℃；干燥氣流速，10 L/min；霧化氣壓力，30 psi；毛細管電壓，4 000 V；碰撞氣，高純氮（N2，純度≥99.999%）；其它質譜參數見表1。

表1 4種有機磷類除草劑的保留時間和質譜參數

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

有機磷類除草劑的結構中均含有N、O等雜原子，在酸性環境中容易結合H+。因此，選擇電噴霧離子源正離子模式（ESI+）進行檢測。以4種有機磷除草劑標準溶液進樣，以全掃描模式（Scan）篩選母離子，結果發現各化合物的[M+H]+峰均響應較強，確定為母離子；在選擇離子掃描模式（SIM）下優化碎裂電壓，以期母離子響應最佳；用產物離子掃描模式確定2個豐度高、干擾小的子離子作為定性離子，同時優化碰撞能，使得2個子離子獲得最佳響應。每個化合物的2個定性離子中響應較高的作為定量離子，最終確定質譜條件。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

色譜柱的填料和粒徑影響目標化合物的色譜分離度和峰形。試驗比較了Agilent ZORBAX XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）、proshell 120 EC-C18（2.1 mm×75 mm，2.7 μm）和ZORBAX Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）3種不同型號色譜柱的分離效果。結果發現，使用ZORBAX XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱時4種目標物的峰形和分離效果最好，分析時間也最短（見圖1）。

2.2.2 流動相的選擇

鑒于有機磷除草劑在酸性環境下易結合H+，因此試驗在水相中加入甲酸。分別比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈（50∶50，V/V）-0.1%甲酸水溶液這3種不同混合體系流動相對4種目標物峰形和響應值的影響。結果表明，當有機相為乙腈時，4個目標峰的分離度較好，但甲基胺草磷響應值較低；當有機相為甲醇時，整體響應值均有提高，但目標峰的分離度相對較差；當有機相為甲醇/乙腈（50∶50，V/V）時，目標物的峰形和分離度均較好，響應也較好。因此，選擇甲醇/乙腈（50∶50，V/V）-0.1%甲酸水溶液作為試驗的色譜流動相。試驗進一步優化了兩相比例，結果發現兩相比為75∶25（V/V）、流速為0.3 mL/min時，色譜峰形和分離度均較好，采用等度洗脫還節省了平衡時間，提高了工作效率。

2.3 樣品提取方法的優化

2.3.1 提取劑的選擇

為獲得高的提取效率，試驗考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈-乙酸乙酯混合液提取體系對4種有機磷類除草劑回收率的影響。表2顯示，采用乙酸乙酯為提取劑時提取效果最好，回收率為78.7%～84.1%。因此，試驗選擇乙酸乙酯為提取劑。

圖1 4種有機磷除草劑混合標準溶液的色譜圖（100 ng/mL）

表2 提取劑對4種有機磷類除草劑回收率的影響

2.3.2 凈化方式的選擇

試驗比較了采用分散固相萃取和C18固相萃取柱凈化時4種有機磷除草劑回收率的影響。結果表明，利用分散固相萃取法凈化的回收率明顯優于C18固相萃取柱。試驗繼續比較了分散固相萃取劑為C18、PSA以及混合使用PSA與C18、PSA與MgSO4對回收率的影響。結果表明，單獨使用1.0 g PSA時回收率最好，為80.6%～87.8%，具體結果見圖2。

2.4 基質效應

基質效應（matrix effect，ME）是指除目標物以外的其他成分對待測物測定值的影響，在質譜使用ESI源檢測時，基質主要影響目標物的離子化，使其響應信號增強的為基質增強效應，使其響應信號減弱的為基質抑制效應。試驗采用同一質量濃度的4種有機磷類除草劑基質空白溶液和甲醇/乙腈-水溶液（75∶25，V/V）按照儀器條件進行測定，以響應峰面積的比值評價基質效應。ME值在80%～120%之間，表明基質效應較小；ME值低于80%或高于120%，表明有較強的基質抑制或增強作用。由表3可見，哌草磷的ME值為103.3%～108.9%，基質效應較小；其他3種有機磷類除草劑ME值為42.7%～68.3%，存在較強的基質抑制效應。因此，采用基質匹配標準溶液進行外標法定量以減少基質效應的影響。

圖2 不同凈化方式及凈化劑用量對4種有機磷除草劑回收率的影響

表3 蜂花粉中4種有機磷類除草劑的基質效應

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限

用蜂花粉基質空白溶液配制4種有機磷類除草劑質量濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL的系列混合標準溶液。按照儀器條件進行測定，以質量濃度為橫坐標（X，ng/mL），對應定量離子的峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。在1.0～200.0 ng/mL范圍內，4種有機磷類除草劑的線性關系良好，相關系數（r2）＞0.999。平行測定11個空白蜂花粉樣品，4種有機磷類除草劑檢出限（LOD，S/N=3）為0.02～0.05 μg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）為0.07～0.16 μg/kg，結果見表4。

2.5.2 方法的準確度與精密度

取蜂花粉空白樣品，加標濃度分別為5，20和50 μg/kg，每個加標水平平行測定5次，計算平均加標回收率和相對標準偏差（δRSD）。由表5可知，4種有機磷類除草劑的平均回收率在72.2%～89.1%之間，δRSD在2.0%～8.9%之間。結果表明，該方法準確度較高、精密度好，可滿足蜂花粉中4種有機磷類除草劑的檢測要求。

表4 4種有機磷類除草劑的線性關系、檢出限和定量限

表5 蜂花粉中4種有機磷類除草劑的加標回收率與相對標準偏差（n=5）

2.6 實際樣品檢測

采用所建立方法對石家莊市售10份蜂花粉樣品進行檢測。其中，4份檢出甲基胺草磷，含量在0.79～4.53 μg/kg之間；3份檢出莎稗磷，含量在0.19～1.58 μg/kg之間；4份檢出抑草磷，含量在0.23～0.89 μg/kg之間；4份檢出哌草磷，含量在3.79～33.17 μg/kg之間。結果表明，蜂花粉中存在除草劑的殘留污染，相關部門應對其污染進行風險評估，加快制定蜂花粉中除草劑的相關限量標準。

3 結論

首次建立了同時檢測蜂花粉中4種有機磷類除草劑（甲基胺草磷、莎稗磷、抑草磷和哌草磷）殘留的HPLC-MS/MS分析方法，4種除草劑在1.0～200.0 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，檢出限在0.02～0.05 μg/kg之間，定量限在0.07～0.16 μg/kg之間。該方法靈敏度高、準確度和精密度好、操作簡單，可滿足檢測要求。