UPLC-MS/MS法測定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及代謝物

尹青春 ，譚高好，鄧浩，潘永波，張容鵠，徐彬

1.海南省農業科學院農產品加工設計研究所，海南省熱帶果蔬冷鏈研究重點實驗室（海口 570100）；2.海南省食品檢驗檢測中心（海口 570100）

硝基咪唑類藥物是一類具有5-硝基咪唑環共同結構的合成抗菌類藥物，常見的有甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、羥甲基甲硝咪唑等。硝基咪唑類衍生物易與生物體內的許多大分子如酶、DNA和受體等發生超分子結合[1]，在抗癌[2-3]、祛痘[4]、抗厭氧菌[5]、抗寄生蟲[6]等方面有廣泛醫學用途。此外，使用此類藥物對動物體重還具有增加作用[7]，因此在畜禽養殖中被廣泛違法使用。有研究表明，硝基咪唑類藥物和其代謝物具有致突變和致癌性[8]，禽類肉和蛋制品中的硝基咪唑類藥物殘留對消費者健康構成直接威脅。

我國和歐盟已將硝基咪唑類藥物列為動物性食品不得檢出的對象。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[9]及《農業部公告第235號》[10]明確規定地美硝唑、甲硝唑允許作治療用，但不得在動物性食品的所有可食組織中檢出。歐盟理事會也將硝基咪唑類藥物列入A類禁用藥物，不得在任何食品中檢出[11]。但違法使用硝基咪唑類藥物現象屢禁不止，雞蛋等農產品抽檢不合格仍時有發生。

超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法具有快速、高效、高特異性、高靈敏度等特點，是目前檢測硝基咪唑類藥物殘留的常用方法。李小橋等[12]使用UPLC-MS/MS法測定牛肉中4種硝基咪唑類藥物殘留量。雞蛋樣品中多種硝基咪唑類藥物及其代謝物的UPLC-MS/MS批量檢測方法尚未見報道。此次試驗從提取溶劑、凈化方式、復溶液、液相流動相、色譜柱、質譜條件等參數進行優化，建立UPLC-MS/MS方法，同時測定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物，為政府監管部門提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantiva三重四極桿質譜儀[配有電噴霧離子（ESI）源]、Ultimate 3000超高效液相色譜儀，美國Thermo公司；Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機（Eppendorf公司）；多管渦旋混合器（德國Heidolph公司）；Mettler XS204型十萬分之一分析天平（美國Mettler Toledo公司）；SCIENTZ-950E超聲波提取器（寧波新芝生物科技公司）。

16種硝基咪唑混標（100 μg/mL，A ChmTek.Inc.），其它均為色譜純。雞蛋購于海口市秀英區秀英街道向榮村農貿市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準工作溶液的配制

準確稱取適量羥甲基甲硝咪唑、羅硝唑D3標準品，配制成質量濃度為100和1.0 μg/mL的標準使用溶液；17種混合標準使用溶液（1.0 μg/mL）：準確吸取100 μg/mL 16種硝基咪唑混標和100 μg/mL的羥甲基甲硝咪唑標準使用溶液各100 μL，用甲醇定容至10 mL。所有標準使用溶液置于-18 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 樣品前處理

將雞蛋樣品混合均勻并準確稱取2.0 g，加入100 μL質量濃度為1.0 μg/mL的羅硝唑D3的內標標準使用溶液，再加入10 mL 1%甲酸乙腈，漩渦10 min，超聲10 min，以10 000 r/min離心5 min；凈化：取2.0 mL上清液，加入200 mg C18，漩渦10 min，以10 000 r/min離心5 min，取1.0 mL上清液，于40 ℃氮吹干，加入1.0 mL 50%甲醇水溶液復溶，過0.22 μm有機相膜，上機測定。

1.3 儀器條件

色譜柱，ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A，0.1%甲酸水溶液；流動相B，甲醇溶液；柱溫35 ℃；進樣量5.0 μL，流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.25 min，5% B；0.25～3 min，5% B～65% B；3～4 min，65% B～99% B；4～5 min，99% B；5～5.01 min，99% B～5% B；5.01～7 min，5% B。

質譜：離子源ESI源，正離子模式；掃描模式：選擇反應監測（SRM）模式；噴霧電壓3.5 kV；汽化溫度350 ℃；離子傳輸溫度 350 ℃；鞘氣（氮氣）壓力32 Arb；輔助氣（氮氣）壓力5 Arb；碰撞氣：高純氬氣，壓力為1.5 mTorr。優化后17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的質譜參數見表1。

表1 17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的質譜參數

2 結果與討論

2.1 色譜柱的篩選

試驗對比了Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Thermo Accucore C18（2.6 μm，2.1×100 mm）和ACE Ultra Core 2.5 Super C18（2.5 μm，2.1 mm×100 mm）3種色譜柱對17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離效果。圖1為Waters BEH C18色譜柱的目標化合物總離子色譜圖，其分離效果最好。劉燕等[13]在研究超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用（UPLC-Q-Exactive Orbitrap）快速檢測飼料中16種硝基咪唑類藥物時也發現Waters BEH C18色譜柱對16種硝基咪唑類藥物的檢測靈敏度及色譜峰型較好。因此選擇Waters BEH C18進行方法研究。

圖1 目標化合物總離子色譜圖（BEH柱）

2.2 流動相的篩選

試驗對比了0.1%甲酸水/甲醇、5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）/甲醇、0.1%甲酸水/乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）/乙腈4種不同流動相體系對17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離及響應效果。結果表明：體系含有甲醇的流動相對大部分硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離效果均較好，其中0.1%甲酸水/甲醇的色譜峰型、信號響應、穩定性最優。周興鑫[14]在建立生鮮乳中250種獸殘高通量快速篩查平臺時發現流動相中加入0.1%的甲酸對于各化合物響應強度具有明顯的提高。因此選擇0.1%甲酸水/甲醇作為體系的流動相。

2.3 樣品提取液的篩選

分別以甲醇、乙腈、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈等11種有機溶劑作為提取液，對比17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的提取效果。結果表明：使用1%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取時，回收率為70%～130%，且1%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取效果無明顯差異，考慮到綠色環保，選擇1%甲酸乙腈作為提取液。

2.4 凈化方式的篩選

已有文獻報道采用Waters PRIME HLB、MCX[15]、PCX[16]、RETAIN-CX等作為凈化樣品的固相萃取柱，還有采用PSA[17-18]、MgSO4、C18或者幾種混合作為凈化樣品的吸附劑。基于以上文獻報道，試驗比較了MCX、HLB、PSA、C184種凈化方式的凈化效果，以加標量為50 μg/kg的回收率為指標，凈化效果最好的是Agela Cleanret S C18，目標物回收率達90%～110%，其他3種凈化方式回收率浮動較大。因此，采用200 mg Agela Cleanret S C18吸附劑進行樣品凈化。

2.5 復溶液的選擇

取1 mL凈化后的提取液，經氮氣吹干濃縮后，對比不同比例的乙腈和甲醇作為復溶液對目標物回收率的影響。結果顯示：使用1%乙腈水、5%乙腈水作為復溶液時，大部分目標物的峰型較差；使用10%甲醇水作為復溶液時，小部分目標物的峰型不好；使用50%和80%甲醇水溶液時，各目標物峰型較好，且均可獲得較為滿意的回收率。考慮到成本，選擇50%甲醇水溶液為復溶液。

2.6 線性范圍、檢出限、定量限、精密度

采用優化好的UPLC-MS/MS參數進行方法學研究，結果如表2所示。17種硝基咪唑類藥物及其代謝物均呈現良好的線性關系，線性范圍為1.0～100 ng/mL，相關系數r≥0.999 0，羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、噻苯噠唑、奧硝唑、阿苯噠唑亞砜、異丙硝唑、奧芬達唑、甲苯咪唑、阿苯達唑、氟苯咪唑和芬苯達唑的檢出限分別為0.056，0.115，0.065，0.046，0.026，0.088，0.115，0.032，0.016，0.083，0.010，0.016，0.004，0.006，0.005，0.010和0.003 μg/kg，定量限均為5.0 μg/kg；SN/T 2624—2010[19]規定硝基咪唑類測定低限為1.0 μg/kg；SN/T 1626—2019[20]規定羥甲基甲硝咪唑測定低限為1.0 μg/kg，甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、奧硝唑測定低限均為0.5 μg/kg。方法的檢出限均低于標準方法檢測低限，說明該檢測方法靈敏度較高。對質量濃度為10.0 ng/mL的17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的標準溶液進行6次重復測定，該方法的δRSD（n=6）為0.4%～2.3%，說明儀器具有良好的精密度。

表2 17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的線性關系、檢出限、定量限

接表2

2.7 回收率試驗

將17種目標化合物添加到空白雞蛋樣品進行50，100和250 μg/kg 3個水平的添加回收試驗，每個水平取6個平行樣，平均回收率為73.1%～117.7%，方法的相對標準偏差δRSD為0.6%～6.5%，說明該方法回收率及重復性較好。

2.8 樣品測定

采用試驗建立的UPLC-MS/MS方法對海南省18個市縣菜市場抽檢的雞蛋樣品共78批次中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的殘留量進行測定，每個樣品平行測定2次，結果均未檢出此類獸藥。雖然，目前在抽檢的雞蛋中均未檢出17種硝基咪唑類藥物及其代謝物，但仍需加強此類獸藥殘留檢測的監控。

3 結論

通過優化分離條件和樣品提取凈化條件，建立了UPLC-MS/MS內標法測定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的方法。樣品經1%甲酸乙腈提取，經C18吸附劑凈化，以ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱分離，0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相梯度洗脫，電噴霧正離子模式（ESI+），多重反應監測（MRM）掃描，洛硝噠唑內標法定量，其他16種硝基咪唑類藥物及其代謝物外標法定量。結果顯示，17種目標化合物在1.0～100 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數r≥0.999 0，在3個不同濃度添加水平下，平均加標回收率為73.1%～117.7%，方法δRSD為0.6%～6.5%，檢出限為0.003～0.115 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg。該方法前處理簡單，具有凈化效果好、準確快速的特點。測定海南省18個市縣抽檢的雞蛋樣品（共78批次），結果均未檢出此類獸藥。該方法適用于大批量雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的快速篩查、確證及定量。