花青素納米纖維智能標簽對羊肉新鮮度的無損檢測

孫武亮，李文博，靳志敏，靳 燁，孫文秀※

（1. 內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018；2. 內蒙古自治區市場監督管理審評查驗中心，呼和浩特 010070）

0 引 言

近年來，隨著人們生活水平的提高，食品安全問題受到了廣泛重視。肉類可以為機體提供微量元素，是重要的礦物質來源，已成為日常飲食中不可或缺的部分，所以對其安全性的控制與檢測尤為重要[1-2]。究其根本，要解決肉類安全性問題，首先要實現其新鮮度的實時檢測，這樣才能有效控制產品流通與銷售，進而達到提高肉類安全性指數的目的。肉類新鮮度級別由揮發性鹽基總氮含量（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）劃分，但傳統檢測方法過于復雜，且耗時較長，不能實現實時檢測。因此，為實現肉類新鮮度的無損及可視化檢測，讓普通大眾也可獲悉產品品質優異的目的，研究者們開始著眼于開發可對肉類特征性腐敗物質具有響應性的智能標簽。

目前，檢測肉類新鮮度的智能標簽大多是基于指示材料對包裝環境的pH值敏感性而制備的，其可以在不同pH值條件下顯示出不同顏色，進而實現新鮮度的分級與檢測[3-4]。隨著人們對肉類安全的重視，基于合成型pH敏感材料（二甲酚藍、溴甲酚綠、溴甲酚紫、甲酚紅、甲基紅和溴百里酚藍）和天然型敏感材料（花青素和茜素）的智能指示標簽均已被制備[4-9]。在這些研究中，雖然可以對肉類新鮮度進行無損、實時及可視化檢測，但大多只采用TVB-N和菌落總數進行新鮮度劃分，指標過于單一，準確性不高。并且這些新鮮度指標在與標簽顏色變化進行相關性分析時，也只是粗略的用肉類腐敗閾值和標簽顏色進行比對，不能實現對肉類剩余貨架期的預測。由此可見，肉類新鮮度的檢測及其剩余貨架期的預測尚不全面，準確性有待進一步驗證，不利于解決肉類安全問題。綜上所述，為實現肉類新鮮度較為準確的無損、實時及可視化檢測，以及剩余貨架期的預測，明確智能標簽顏色變化與新鮮度指標的關系，參考Sun等[10-11]制備的納米纖維膜方法，制備花青素納米纖維智能便簽應用于羊肉新鮮度檢測中，結合方差分析和相關性分析，建立智能標簽對羊肉新鮮度的預測模型，為肉類新鮮度的無損、實時及可視化檢測開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：納米纖維膜由Sun等[10]提供；羊肉來自內蒙古烏拉特中旗蘇尼特羊育種園區，選取12月齡蘇尼特羊，于6:00吊掛屠宰，去除頭、蹄和內臟后，迅速在胴體上取后腿肉100 g，迅速放入冰盒中，待用。

試劑：氨水、氧化鎂、硼酸、濃鹽酸，均為分析純；PCA（plate count agar）培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；甲基紅、溴甲基酚綠，麥克林試劑。

1.2 儀器與設備

pH-STAR型胴體pH計，德國MATTHAUS公司；CR-20型色差計，日本柯尼卡美能達有限公司；Pro-Nitro A全自動凱氏定氮儀，北京金恒祥儀器有限公司；SEM4000掃描電鏡，日本JSM公司；UV-2450紫外分光光度計，島津企業管理（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米纖維膜的制備

納米纖維膜的制備參考Sun等[10-11]的方法，稱取質量分數為12%的聚乳酸（Polylactic Acid，PLA）置于二氯甲烷（Dichloromethane，DCM）溶液中，并在磁力攪拌器上以500 r/min持續攪拌直至PLA顆粒全部溶解；稱取質量分數為0.4%的花青素溶于二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）中，并在磁力攪拌器上以500 r/min持續攪拌直至花青素全部溶解，隨后將該溶液倒入PLA溶液中，充分混合制成紡絲溶液，其中DCM/DMF的質量比為3∶2。

靜電紡絲步驟參考Sun等[10-11]的方法，將紡絲溶液注入到可以垂直沉降的注射器（體積為10 mL）中，將其放于靜電紡絲機中，選用五噴頭器件進行紡絲。紡絲參數為：正電壓為+ 20 kV；相對空氣濕度為20%；溶液的進料速度為1 mL/h；轉筒速度為150 r/min；纖維絲的空間積累距離為18 cm；空間積累時間為30 min。最后將所得的納米纖維膜放于50 ℃的真空干燥箱中干燥至恒質量。

1.3.2 納米纖維膜的表征

1）掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）

通過掃描電子顯微鏡（SEM-TM4000Plus，Hitachi High-Technologies Corporation，Japan）研究花青素納米纖維膜的表面形貌特征。每幅圖像的最大施加電壓為15 kV，工作距離為1～5 mm。選用image pro 6plus作為SEM圖像的分析軟件。

2）胺敏感性

選用氨蒸汽作為模型氣體，采用頂空方法檢測膜的胺敏感性。依據亨利定律，氨蒸汽濃度通過容器中氨溶液的氣液平衡來控制[12-13]。傳感試驗在25 ℃下、相對濕度54%條件下進行，先向培養皿中注入15 mL濃度為1～100 mg/L的氨水，然后將膜（1 cm×2.5 cm）密封于其中，充分反應24 h后，通過UV-2450紫外分光光度計測定膜的光學吸收變化。

1.3.3 納米纖維膜對羊肉新鮮度的檢測

選取羊后腿肉，放入超凈臺中紫外滅菌20 min，切除表面肉層，并將羊肉均分為25 g放于包裝盒中，將納米纖維膜（1 cm×2 cm）放于頂部，不接觸肉樣。試驗溫度選用大型超市的市售溫度（10±2 ）℃，纖維膜照片拍攝在燈的位置、入射角和強度恒定的燈箱中進行。每天測定感官品質、TVB-N、菌落總數、pH值、酸度/氧化力系數和納米纖維膜的色差值ΔE，直至羊肉徹底腐敗變質。每次試驗設置3個平行，重復進行3次，以驗證結果準確性。

感官評定：選10名經過培訓的評價員對儲藏期間的羊肉進行感官評分，評分標準見表1[14]。

表1 羊肉感官評定表Table 1 Sensory evaluation table of mutton

TVB-N：參考GB 5009.228—2016的方法，利用全自動凱氏定氮法測定TVB-N含量，每個樣品測定3次取平均值。

菌落總數：參考GB 4789.2—2016的方法，選用平板計數法測定肉樣的菌落總數，每個樣品測定3次取平均值。

pH：使用胴體pH計測定羊肉pH值，每個樣品測定3次取平均值。

酸度/氧化力系數：參考朱民望[15]的方法，取10 g肉樣，去除筋膜，切成肉糜，加入90 mL蒸餾水，攪拌均勻后靜置30 min，過濾待用。取10 mL濾液，加入40 mL蒸餾水，混勻后滴加五滴酚酞試劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，當樣液變為淡紅色且半分鐘內不褪色時，消耗的NaOH溶液體積即為酸度值。量取50 mL蒸餾水置于三角燒瓶中，依次加入5 mL 0.2 mol/L硫酸和1滴0.02 mol/L高錳酸鉀溶液，混合加熱至40～50 ℃，再加入10 mL肉樣濾液，立即用0.02 mol/L高錳酸鉀滴定，直至溶液呈玫瑰紅色且30 s內不褪色即為滴定終點，所消耗的高錳酸鉀溶液的體積即為氧化力值。

納米纖維膜的色差：使用色差儀測定纖維膜的顏色，L*為亮度值，a*為紅度值，b*為黃度值，每個樣品測定3次取平均值。色差ΔE計算公式如下

式中L0*，a0*和b0*為纖維膜的初始顏色值，L*，a*和b*為纖維膜使用之后的值。

1.4 數據統計與分析方法

使用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析，使用Origin2018軟件進行作圖分析，選用Image plus pro6軟件測量纖維的直徑，采用JMP Pro 14軟件進行相關性分析、預測模型的建立和模型準確度的計算。模型準確度是預測為正實際為正和預測為負實際負占總樣本的比例。

2 結果與分析

2.1 納米纖維智能標簽的表征

由圖1可知，納米纖維智能標簽宏觀上呈淡粉色，且柔軟輕薄。由SEM的圖像證明，智能標簽微觀上由直徑約為250 nm的平滑、均勻和連續的納米纖維絲構成，無明顯串珠現象。

2.2 胺敏感性

肉在腐敗過程中產生的揮發性氣體中，NH3、二甲胺和三甲胺是幾種主要的堿性特征性揮發性成分[16]。其中NH3是結構最為簡單，且對環境pH值具有直接影響的氣體，所以選用該氣體作為檢測納米纖維智能標簽敏感性的模型氣體[17]。為測定納米纖維膜的胺敏感性，將膜暴露于氨溶液中（1～100 mg/L）過夜后，使用UV-2450紫外分光光度計確定粉色納米纖維復合膜的光學吸收變化，結果如圖2所示。花青素的紫外吸收峰在500～550 nm之間[18]，UV-2450紫外分光光度計檢測到納米纖維膜在533 nm處出現最大吸收峰。隨著氨濃度的增加，膜的吸收峰逐漸下降，當濃度大于70 mg/L時，最大吸收峰基本消失。此反應的感應機制為：納米纖維膜初始呈鮮艷的粉紅色；當暴露于氨蒸汽后，花青素中發生親核加成反應，電子發生轉移，碳原子上的電子轉移到氧原子上，形成了碳正離子；碳正離子吸引游離的氫氧根，雙鍵斷裂成單鍵，最終形成半縮酮；半縮酮是一種無色物質，其在一定溫度下吡喃環可以被打開，進而形成順式查爾酮結構，這種結構也是一種無色物質[19-20]。綜上所述，納米纖維膜在533 nm的紫外吸光度與氨濃度呈反比關系（關系式為：y=0.907 06-0.003 8x，R2=0.989 7），證實了纖維膜從粉色變為白色，可以被肉眼識別，為后期膜在羊肉的新鮮度檢測應用中提供依據。

2.3 納米纖維智能標簽對羊肉新鮮度的監測

2.3.1 羊肉儲藏過程中新鮮度的分級

感官評定、pH值、TVB-N、菌落總數和酸度/氧化力系數是判定肉新鮮度的主要指標，通過測定羊肉儲藏過程中上述指標的變化，實現對羊肉新鮮度的準確分級，并將分級結果與納米纖維智能標簽的色彩變化對比，分析智能標簽對羊肉新鮮度檢測的準確性。

感官評定是通過氣味、色澤和組織狀態實現對肉新鮮度明確的分級，是最為直觀的判定方法。由表2可知，屠宰后的新鮮羊肉具有較好的風味和色澤、肌纖維致密有序、組織狀態較好，感官評分較高，具有較高的食用價值。隨著儲藏時間的增加，羊肉感官評分逐漸下降，在48 h時，羊肉的各項感官評分降至2.20～2.70之間，具體表現為輕微腐敗味的出現、色澤變為暗紅色、輕微的汁液流失、組織狀態松散，食用品質明顯下降。當羊肉儲藏72 h時，出現了明顯的腐敗味，色澤變為深紅色，有較多汁液流失，肉的表面出現粘手現象，肌肉彈性徹底消失，食用品質降至最低。

表2 羊肉儲藏過程中的感官評定結果Table 2 Sensory evaluation results during mutton storage

肉的pH值不僅對嫩度、保水性等品質有較大影響，還在一定程度上影響著肌肉內源酶活性，從而影響蛋白的降解，最終對肉的腐敗進程產生影響，是指示肉品新鮮度的重要指標[21-22]。如圖3a所示，樣品的初始pH值為5.68，分析原因是羊肉此時已進入糖酵解階段，產生了較多乳酸，進而導致pH值偏低[23]。隨后，羊肉的pH值逐漸上升，這可能是由于肌肉氧氣供應不足，肌質網被破壞，大量流失的Ca2+激活了鈣蛋白酶體系，促進了肌原纖維蛋白降解為小分子多肽，部分多肽繼續降解為游離氨基酸，這些游離氨基酸和肽類物質又被微生物利用進而生成胺類物質，最終使pH值升高[24-26]。

揮發性鹽基氮（TVB-N）包括氨及胺類物質，是肉在儲藏過程中，蛋白質、多肽和氨基酸等含氮化合物被內源酶及細菌分解，產生的揮發性堿性物質，如氨、三甲胺、二甲胺、尸胺和腐胺等物質的統稱[27-28]。肉類的TVB-N值小于15 mg/100 g為新鮮肉，15～20 mg/100 g為次鮮肉，大于20 mg/100 g為腐敗肉[29]。由3b可知，羊肉初始TVB-N值為7.6 mg/100 g，儲藏24 h后為11.6 mg/100 g，此時羊肉處于新鮮級別；儲藏48 h時，TVB-N值升至18.8 mg/100 g，此時羊肉已降至次新鮮級；當儲藏72 h時羊肉的TVB-N值已增至32.9 mg/100 g，遠高于腐敗閾值，已經腐敗變質。

微生物是導致肉腐敗的主要原因，冷鮮肉新鮮度的評定標準為：一級鮮度：小于等于5 lgCFU/g，次級鮮度：5～7 lgCFU/g，腐敗：大于等于7 lg CFU/g[30]。由圖3c可知，羊肉儲藏前的菌落總數為2.1 lgCFU/g，此時羊肉處于新鮮階段。隨著儲藏時間的增加，菌落總數在24 h時大幅度增加，羊肉達到次新鮮程度。隨著微生物的迅速生長繁殖，在儲藏48 h時菌落總數增至7.6 lg CFU/g，高于腐敗臨界值，羊肉失去食用價值。

酸度/氧化力系數是肉pH值與氧化力的比值，是羊肉新鮮度的另一指示指標[15]。由圖3d可知，羊肉在儲藏過程中酸度/氧化力系數值呈現下降趨勢（P＜0.05）。原因是羊肉在儲藏期間蛋白質在微生物的作用下被分解產生胺類物質，導致肉的酸度下降，致使酸度/氧化力值整體呈下降趨勢，這與pH值結果規律一致[31]。另一主要原因是隨著羊肉微生物的大量繁殖和生長，導致氧化力增加，致使酸度/氧化力系數顯著降低（P＜0.05）[32]。

綜上所述，羊肉在儲藏過程中，pH值逐漸升高，酸度/氧化力系數逐漸下降，菌落總數在儲藏48 h時達到腐敗閾值；感官評定與TVB-N則在羊肉儲藏72 h時，指示肉已腐敗變質。綜合以上指標，對羊肉進行新鮮度分級，即儲藏時間t＜24 h（新鮮），24 h＜t＜48 h（次新鮮），t＞72 h（腐敗）。

2.3.2 納米纖維膜的色差

為探究納米纖維智能標簽對羊肉新鮮度的監測可行性，以TVB-N作為劃分羊肉新鮮度的主要指標，分析標簽顏色變化與TVB-N的關系，結果如圖4所示。羊肉在儲藏過程中，隨著腐敗程度的增加，在內源性酶和微生物作用下，生成了揮發性生物胺，如氨、三甲胺、尸胺、腐胺等，這些堿性物質揮發后導致環境pH值增加，花青素中的黃酮離子發生水合作用形成了無色的查爾酮結構，致使納米纖維膜產生顏色變化[33-34]。新鮮羊肉的TVB-N值約為7.2 mg/100 g，儲存1 d后TVB-N微增至11.6 mg/100 g，同時納米纖維膜顏色從紅粉色變為淺粉色，ΔE（色差值）為4.9，已能被肉眼所識別[35]。當羊肉儲存3 d時，TVB-N值增至32.97 mg/100 g，表明肉已變質腐敗，同時包裝盒中的納米纖維膜從淡粉色變為白色，ΔE增至13.6，這可以讓一個非專業人士裸眼識別。但根據數據結果顯示，到羊肉儲藏3d時，ΔE誤差較大，同時觀察到標簽顏色在組間差異比較大，個別樣品依舊呈淡粉色，未變成白色。分析原因是，羊肉的初始微生物污染菌株存在差異，導致其產生的揮發性生物胺不同，進而與花青素的反應不同，最終導致標簽最后呈現的顏色不同。總而言之，納米纖維智能標簽顏色變化與肉的新鮮度指示指標TVB-N大致呈現一致的規律，可以依據標簽顏色對羊肉新鮮度進行初步無損檢測。

2.4 智能標簽監測羊肉新鮮度的預測模型及市場應用

2.4.1 新鮮度指標與標簽色差的相關性分析

為分析新鮮度指標與纖維膜ΔE的關系，進行了相關性分析。由表3可知，納米纖維膜ΔE與感官評分呈極顯著負相關（P＜0.001）、與酸度/氧化力系數呈顯著負相關（P＜0.05）；ΔE與TVB-N、菌落總數和pH值均呈極顯著正相關（P＜0.001）。由此可知，ΔE與各指標呈較高的相關性，可以作為肉類新鮮度的評定指標。

表3 羊肉在儲藏期間各指標的相關性分析Table 3 Correlation analysis of various indexes of mutton during storage

2.4.2 預測方程的建立

將感官評分、TVB-N、菌落總數、pH值和酸度/氧化力系數作為因變量，將EΔ 作為自變量進行模擬。使用JMP軟件中的標準二乘法，ΔE的宏選項選用響應面進項。利用JMP軟件進行方程模擬，由表4可以看出，經過模擬，每個指標均被成功模擬出方程，且調整后的決定系數R2均在0.9以上，且極為顯著，這表明模型已成功建立。由于TVB-N值有國標劃分新鮮度的標準，所以選用TVB-N模型作為羊肉新鮮度的預測模型。預測模型如下

表4 模型匯總Table 4 Model summary

2.4.3 市場應用及模型驗證

將納米纖維膜制成符合市場要求的智能標簽，根據上述TVB-N模型方程對標簽指示肉品新鮮度的剩余貨架期進行預測，并應用于市場中做進一步驗證。試驗樣本選取市售的內蒙古蘇尼特羊后腿肉，包裝方式為托盤包裝，儲藏溫度與建立模型的溫度一致（（10±2） ℃）。由圖 5可知，納米纖維智能標簽可對羊肉新鮮度進行初步可視化監測，消費者能通過標簽明顯的顏色變化裸眼識別肉品新鮮度。智能標簽的價格估算如表5所示，一個標簽總價格約為0.002 7元。為驗證標簽檢測的準確性，JMP軟件自動比對了羊肉真實TVB-N值與預測TVB-N值，結果如圖6所示，發現二者呈正相關，且誤差較小，預測準確度達88.2%。綜上所述，智能標簽價格低廉、方便快捷、操作簡便，在肉類的無損、實時及可視化檢測領域具有很大的應用前景，可實現肉類在生產、流通和銷售過程中的新鮮度檢測。

表5 納米纖維膜的價格估評Table 5 Price evaluation of nanofiber membrane (1 cm×2 cm)

3 結 論

1）花青素納米纖維智能標簽由直徑約為250 nm的纖維絲構成，表面呈淡粉色，具有較好的胺響應性，智能標簽在533 nm的紫外吸光度與氨濃度呈反比關系R2=0.989 7。

2）智能標簽可初步應用于羊肉新鮮度的實時及可視化檢測中，其顏色變化與TVB-N大致呈現一致的規律。

3）標簽顏色變化與各新鮮度指標有明確的線性關系，R2均大于0.9，根據色差值ΔE可預測羊肉新鮮度以及剩余貨架期，準確率可達到88.2%，同時該標簽價格低廉，只需0.002 7元，為今后實現肉類新鮮度實時、無損和可視化檢測提供了新的方向與選擇。